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植物基因组DNA的分离纯化及RAPD扩增

发布时间: 2016-05-23  点击次数: 391次

1、植物基因组DNA的分离纯化
一、实验原理
核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA是双链线性分子,原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子,有些噬菌体DNA有时为单链环状分子。95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内,其它5%为细胞器DNA,如线粒体、叶绿体等。
从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA,其中还含有大量RNA,即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。
盐溶法是提取DNA的常规技术之一。在制备核酸时,通常是用研磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。利用DNA不溶于0.14mol/L 的NaCl溶液而RNA能溶于0.14mol/L 的NaCl溶液这一性质可以将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开。
分离得到核蛋白后,还需进一步将蛋白等杂质除去。去除蛋白的方法有 3种:① 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除 去变性蛋白质。用这种方法处理时,蛋白质停留在水相和氯仿相中间,而 DNA则溶于上层水相,用两倍体积95%乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,从而使其与核酸分离,也可 从材料中直接提取出DNA。③ 用苯酚处理,然后离心分层,一样可以将DNA 与蛋白质分离开来。这时DNA溶于上层水相,蛋白变性后则停留在酚层内, 吸出上层水相,加入两倍体积的95%乙醇即可得到白色纤维状DNA沉淀。反复 使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液,就能将蛋白等杂质较*地除去, 得到较纯的DNA制品。本实验采用CTAB法从植物幼苗中提取基因组DNA。 
为了*除去DNA制品中混杂的RNA杂质,可用RNA酶进行处理。另外, 生物材料中还含有大量的脂肪物质和多糖,这些物质在用盐溶液分离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可被除去。 
核酸纯化目标:纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的重金属离子;其它生物大分子物质如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到zui低程度;排除RNA分子污染。
操作注意事项:尽量简化操作步骤,缩短提取过程减少各种有害因素对核酸的破坏;减少化学因素对核酸的降解,一般pH4-10;减少物理因素如机械切力、高温对核酸的降解。
提取步骤:破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质、多糖和脂类分子,去除RNA,去除盐类、有机溶剂等杂质。方案:视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定。

二、仪器设备 
高速离心机、水浴锅、电子天平、冰箱

三、材料及试剂
1. 材料:水稻幼苗
2. 试剂:
① 2×CTAB提取液(内含2%CTAB、1.4mol/L NaCl、25mmol/L EDTA、0.2%?-巯基乙醇和0.1mol/LTris-HCl,pH8.0):取2g CTAB、8.18g NaCl、0.74g EDTA-Na2.2H2O,加入10ml 1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)和0.2ml?-巯基乙醇,加双蒸水(ddH2O)定容到100ml; 
② 氯仿:异戊醇(24:1) 
③ 洗涤缓冲液(70%乙醇,内含10mmol/L乙酸铵):取70mL无水乙醇和0.077g乙酸铵,加双蒸水定容到100ml; 
④ 无水乙醇、70%乙醇;
⑤ TE缓冲液:内含10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA,pH8.0

四、操作步骤
① 取水稻幼苗,液氮研磨成粉,迅速分装于Eppendorf 管中,加入0.7ml 60℃水浴中预热的2×CTAB提取液和20ulb-巯基乙醇,轻轻转动使之混匀;
② 样品于60℃温浴45min,每5min将Eppendorf管上下颠倒混匀;
③ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,室温下放置5min,6000g离心10min。 
④ 上层溶液转入另一个干净Eppendorf 管中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀,6000g转离心5min;
⑤ 重复步骤④ 2-3次,直至无白色界面物质 ;
⑥ 将上层水相吸入另一干净的离心管中,加入2/3体积的预冷异丙醇,轻轻混匀使核酸沉淀下来。在-20℃下放置30min,4℃、10000g转离心10min,弃上清液;
⑦ 沉淀用加入1ml洗涤缓冲液,10000g离心1-2min; 
⑧ 沉淀用无水乙醇洗1次, 10000g离心1-2min;
⑨ 沉淀置于空气中3-5min,晾干后加入15-20 ul无菌水溶解;DNA含量测定及电泳检测,琼脂糖浓度为0.8%。
取2-5ulDNA溶液稀释至100ul,于紫外核酸蛋白检测仪上测定A260、A280和A320的OD值,并计算DNA浓度和得率。
注:核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm,在波长260nm紫外线下,1ug/mL的DNA溶液A260=0.020,1个OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ml,单链DNA或RNA为40ug /ml,单链寡核苷酸为20ug/ml。纯的DNA的A260/A280在1.8左右。