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如何从动物肝脏中提取DNA

发布时间: 2016-05-18  点击次数: 632次

一、原理:
在浓氯化钠(1—2mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很大,核糖核蛋白的溶解度很小,在稀氯化钠(0.14 mol/L)溶液中,脱氧核糖核蛋白的溶解度很小,核糖核蛋白的溶解度很大。因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液,将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。
将抽提得的核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理,DNA或(RNA)即与蛋白质分开,可用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去,而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇,DNA即析出。
为了防止DNA或(RNA)酶解,提取时加入EDTA(乙二胺四乙酸)
二、实验材料与仪器:
1、小白鼠肝脏
2、匀浆器
3、离心机5000r/min
4、量筒50ml(×1),25 ml(×1),10 ml(×1)
5、 吸管5 ml(×2)
6、水浴锅
7、真空干燥器
三、试剂:
1.5 mol/LNaCL溶液:将292.3gNaCL溶于水,稀释至1000ml。
2.0.14mol/LNaCL—0.15mol/L EDTA—Na溶液: 溶8.18gNaCL及37.2gEDTA—Na于蒸馏水,稀释至1000ml。
3.25%SDS溶液: 溶25g十二烷基硫酸钠于100ml45%乙醇
4.0.015 mol/L NaCL—0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液: 氯化钠0.828 g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水,稀释至1000ml。
5.氯仿—异戊醇混合液:氯仿:异戊醇=24:1(V/V)。
6.1.5 mol/L NaCL—0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液:氯化钠82.8 g及柠檬酸三钠34.1 g溶于蒸馏水,稀释至1000ml。
7.3 mol/L乙醇钠—0.001 mol/L EDTA—Na溶液: 称取乙酸钠408 g,EDTA—Na0.372g溶于蒸馏水,稀释至1000ml。
8.70%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,无水乙醇。
9.二苯胺试剂
10.1 mol/L过氯酸溶液:将10ml过氯酸(70%)用蒸馏水稀释至110ml。
四、操作:
1. DNA的分离纯化:
(1)将10头小白鼠迅速杀死,取出肝脏,用0.14mol/LNaCL—0.15mol/L EDTA溶液洗去血浆,剪碎,加入50ml0.14mol/LNaCL—0.15mol/L EDTA溶液,置匀浆器
中研磨,待磨成糊状后,将糊状物离心10分钟(4000r/min),弃去上清液,沉淀用0.14mol/LNaCL—0.15mol/L EDTA溶液洗二,三次,所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。
(2)向上述沉淀物加入0.14mol/LNaCL—0.15mol/L EDTA溶液,使总体积为44ml,然后滴加25%SDS溶液3ml,边加边搅拌,加毕,置60水浴保温10分钟(不停搅拌)溶液变的粘稠并略透明,取出冷至室温。此步操作是使核酸与蛋白质分离。
(3)加入5mol/LNaCL10ml,使NaCLzui终浓度达到1mol/L,搅拌10分钟,加入月约一倍体积的氯仿—异戊醇混合溶液,振摇20分钟,离心10分钟(4000r/min)。去掉沉淀,上层清液徐徐加入1.5—2倍95%乙醇,DNA沉淀即析出,用玻棒慢慢搅动,则DNA丝状物即缠在玻棒上。
(4)将DNA粗品置于27ml.0.015 mol/L NaCL—0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,再加入3ml 1.5 mol/L NaCL—0.15 mol/L柠檬酸三钠溶液,搅匀,加入一倍体积氯仿—异戊醇混合液,振摇十分钟,离心(4000r/min,10分钟),倾出上层液体(沉淀弃去),加入1.5倍体积95%乙醇,DNA即沉淀析出。离心,弃去上清液,沉淀(粗DNA)按本操作步骤重复处理一次。
(5)将上步所得沉淀于27ml 0.015 mol/L NaCL—0.0015 mol/L柠檬酸三钠溶液中,然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇,边加边搅,取出丝状DNA,依次用70%,80%,95%以及无水乙醇各洗一次,真空干燥。
2. 鉴定: 用二苯胺法测定DNA。