AFLP分子标记实验

扩增片段长度多态性Amplified fragment length polymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。 
其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。 

一、 实验材料 
采用青稞叶片提取总DNA。 

二、 实验设备 
1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统， 
2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机， 
3.美国MJ公司PCR仪， 
4.安玛西亚电泳仪等。 

三、 实验试剂 
1. 试剂：请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。 
DNA提取试剂盒； 
EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒； 
Taq酶，dNTP, PCR reaction buffer； 
AFLP引物； 
琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料； 
超纯水（18.2MΩ·cm） 
2．其他实验需要物品 
微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。 

四、 实验流程 
1、 总DNA提取 
使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。 
2、 EcoR1酶消化（20ul体系/样品）
AFLP分子标记实验
3、Mse1酶消化（20ul体系/样品）
AFLP分子标记实验
5、 预扩增（20ul体系/样品）
sample 4ul
Primer(Mse1/EcoR1) 1ul 
AFLP Core Mix 15ul
* AFLP Core Mix 配方：
ddH2O 13.8ul
MgCl2 1.6ul
dNTPs(2.5mM) 1.6ul
Taq酶(1U/ul) 1ul
10×Buffer 2ul