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原位PCR和原位RT实验介绍

发布时间: 2016-05-03  点击次数: 445次

(二)、操作流程 

1、原位PCR步骤
1)预处理:
(1)切片常规脱蜡;
(2)0.2mol/L HCl处理10min;
(3)5μg/ml蛋白酶k消化组织37℃10min;
(4)Nase消化组织37℃ 30min;
(5)梯度酒精脱水,室温干燥。
2)原位扩增:
(1)切片滴加特异性序列引物30μLpcr扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
(2)PCR热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30个循环,72℃延伸10min;
(3)氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脱水,干燥。
3) 原位杂交:
(1)加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交。
(2)杂交后用2×SSC洗涤10min,3次,1×SSC洗涤10min,3次;
(3)缓冲液洗涤10min,3次;
(4)加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物,37℃,2h;
(5)缓冲液洗涤5min,3次;
(6)NBT、BCIP暗处显色,镜下控制,终止显色。
(7)常规脱水:透明、封固。

2、原位RT-PCR步骤
1)预处理:
(1)蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min,蒸馏水洗;
(2)95℃加热3min,灭活残存的蛋白酶。
2)原位扩增:
(1)在有RNA酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
(2)用热启动法进行PCR扩增。标本加热至75℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃,2min。再将热循环仪设定为95℃,45s,55℃,1min和75℃,45s,共26次循环;
(3)扩增结束后,在80℃烤15min~30min。
3)原位杂交:
(1)杂交前标本95℃加热3min;
(2)加上杂交液,湿盒内50℃;杂交液组成:25%硫酸葡聚糖,2×SSC,50%甲酰胺,0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA, 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng。
(3)扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。