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基因与载体的重组(重组体的构建)

发布时间: 2016-02-22  点击次数: 561次

目的基因与载体的重组(重组体的构建)程序如下:

(1)质粒dna的分离纯化。一般含有单个目的基因的DNA片段,即使进入了宿主细胞也不能进行增殖。通常它需要同适当的能自我复制的DNA分子(例如质粒、噬菌体DNA等)结合后,才能在通过转化或其他途径导入宿主细胞,像正常质粒或病毒一样增殖和易于检测。分离质粒载体DNA有许多方法,但其共同步骤是先用溶菌酶处理含有质粒载体的宿主菌培养物,以除去其细胞壁,然后加入去污剂(例如SDS),使其发生温和的溶菌作用。这样质粒DNA、多聚核糖体、可溶性蛋白质、tRNA等细胞内的大分子物质便逐步地释放出来,而核染色体的DNA则仍然附着在细胞的残渣碎片上,经过离心处理,可使其同质粒分开。将离心所得的含有质粒DNA的上清液,加酚处理除去蛋白。剩下的DNA混合物中,质粒DNA(cccDNA)呈超螺旋状态。为进一步纯化出cccDNA分子,可在含有溴化乙锭(EB)染料和氯化铯溶液中进行密度梯度离心。EB是一种扁平分子,它能插入双链DNA分子的两个相邻碱基对之间,从而降低了DNA分子在氯化铯中的密度。又由于cccDNA同EB的结合能力比开环DNA和线性DNA低得多,这样在氯化绝密度梯度中便可容易地将cccDNA同其他两种类型的DNA分离开来其他载体DNA分高纯化的原理与上述类似。

(2)目的基因与载体的连接。外源DNA片段与载体DNA分子的连接,即DNA分子的体外重组,主要依赖于限制性内切核酸酶及dna连接酶的作用。在进行连接时,一般需要注意以下几点:① 实验步骤尽可能简单容易;② 在连接后,接点序列能被一定的限制酶重新酶切,以便回收插入片段;③ 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

连接方法一般有两种。一种是用用两种不同的限制酶同时酶解一种特定的DNA分子,产生具有两种不同末端(粘性末端与另种粘性末端、粘性末端与平齐末端)的DNA片段,那么可实现外源DNA片段定向插入载体分子。另一种是非互补粘性末端DNA分子的连接。即在一定的反应条件下,可用T4 DNA连接酶将平齐末端的DNA片段有效地连接起来;对于非互补粘性末端DNA分子,在用特异作用干单链DNA的s1核酸酶处理,使其变成平齐末端后,也可用 T4 DNA连接酶进行有效的连接。另外,可采用附加衔接物(linker,是一种人工合成的双链DNA短片段,其上具有一个或数个在将与其连接的载体DNA上不存在的限制酶识别位点,可按平齐末端连接法给平齐末端片段加上相同识别位点的衔接物,再用在衔接物中具有识别位点的合适限制酶切割,用常规方法连接)的方法,提高平齐末端间的连接作用效率。也可利用接头进行DNA平齐末端门的连接。接头(adaptor)是一种具有粘性末端的短核昔酸双链,它与平齐末端连接后,不用经过切割即可与载体相连。

为了使连接反应物中尽可能多的外源DNA片段插入载体分子,以形成重组DNA,必须阻止在限制酶切割后线性载体分子的自身环化作用。具体可采用以下方法:
(1)用碱性磷酸酶处理限制酶酶解产生的线性载体分子。碱性磷酸酶可除去线性载体DNA分子的5¹-磷酸,而留下3¹-羟基基团。经过碱性磷酸酶处理的线性载体分子,除非插入外源dna片段,否则就不能重新环化为有功能的载体分子。
(2)采用同聚物加尾连接技术,可自动防止线性载体DNA分子的自身环化作用,这是因为切割后形成的线性DNA分子的两个3¹-OH末端,此时都已被加上具有同样碱基结构的同聚物尾巴。
(3)应用柯斯质粒,也可防止质粒DNA分子发生自身环化作用。需要指出的是,在连接反应中,正确配加载体DNA与外源DNA间的比例,是获得重组体的一个重要因素。在应用λ噬菌体或柯斯质粒作载体时,如果配置高比值的载体DNA/外源DNA的连接反应体系,就有利于重组体分子的形成;在应用质粒作载体时,因为其重组体分子是由一个载体分子和一个外源DNA片段环化而成的,所以当载体DNA与外源DNA的比例为1时,zui有利于重组体分子的形成。