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反义RNA技术改良技巧

发布时间: 2016-01-27  点击次数: 547次

用反义rna分子来调节基因表达时,经常会遇到的困难是反应模板的稳定性差。因此,人们正在探索如何改进反义基因的新方法,目前主要有:

(1)优化反义RNA的结合。反义RNA链的长度对抑制基因的效果是重要的。双螺旋形成过程中将释放能量,RNA链越长,释放的自由能越多。从这一意义来讲,可以说长RNA作为反义RNA更有效。但是,并没有关于反义RNA长度的一般规则。Nellen和Lichtentein曾指出,有关反义RNA技术的一个普遍问题是,怎样使反义RNA更有效,即怎么样使一个互补的RNA成为有效的反义RNA。在植物中覆盖整个cDNA的反义RNA有效地抑制了基因表达。但是,与5¹或3¹端部分mRNA互补的反义RNA效果同样好。zui小的反义RNA只有41个核苷酸。

反义RNA的二级结构对双螺旋的形成至关重要。因为形成双链结构必须克服正义和反义RNA本身的二级结构,比潜在自由能的量更重要的是形成双螺旋的作用能量,也就是说,双螺旋构象是由动力学控制的,而不是由释放的自由能的量控制的。原核生物中自然发生的RNA可以很好的说明RNA结构与形成双螺旋构象的速度之间的复杂关系。Simons和Kleckner指出,许多非常有效的反义RNA通常较短(约70个核苷酸),含有一个典型的茎环结构。例如大肠杆菌R1质粒的拷贝数受反义 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者详细研究了这一系统,其正义和反义RNA由同一DNA编码,但以相反方向转录。因此,点突变一点也不能改变这两种RNA的互补性,但是当同时改变正义和反义RNA环区时,虽然两条RNA链*互补,但结合率下降了三至四倍。与此同时,质粒拷贝数却增加了。很显然,结合率受正义和反义RNA二级结构的影响。两条RNA链形成双螺旋的初始“吻合”结构非常重要。

毫无疑问,内源的正义RNA不能被改变,但反义RNA的靶结合区及反义RNA的长度是可以改变的。这将影响反义RNA的二级结构,从而改变其结合能力,使其与靶RNA结合更有效。Rittner等令人信服地证明了反义RNA的长度与它的结合率之间的复杂关系。他们用一个5¹端长度固定的人免疫缺陷型I型病毒(HIV-I)的反义RNA,改变其3¹端,从而改变了RNA长度。然后选择能够快速结合的反义RNA,发现结合率长度之间的关系依长度和相应二级结构的不同而摆动。3¹端只有几个核苷酸不同的反义RNA结合率变化可达上百倍。这与反义RNA的二级结构的改变有关。而且,体外的结合率与体内抑制HIV-I增值的有效性一致。这些结果也证明了在体内应用反义RNA抑制靶基因之前,在离体条件下实验的重要性。

在优化反义RNA的实际长度以前,也可以用计算机辅助分析靶RNA,以寻找有效的靶RNA序列,通过设置一个50~400核苷酸的窗口,Sczakiel等设计了基因组和非基因组HIV RNA的能量。这些能量反映了区域折叠能力。观察到高△G值(低自由能)区域与抑制HIV复制的zui有效区相对应。

(2)延长反义RNA的半衰期。原核生物中自然发生的反义RNA极其稳定,可能是由于它们特殊的茎环结构保护它们免受核酸外切酶的降解。据报道,通过控制插入序列IS10的RNA-OUT,能在体内稳定存在70 min,达三代之久。在反义RNA的末端加上这些保护性的茎环结构,可以减少核酸外切酶的降解。Heinrich等应用了这一方法。zui近,Bourque和Folk报道,一个变相方法是把反义RNA与tRNA连接,用一个依赖于DNA的RNA聚合酶III特异启动子来表达。

(3)在细胞质中表达反义RNA。另一个能够获得高水平表达的反义RNA的方法是在一个游离的复制系统中表达反义基因。这种系统不同于转基因于细胞核内染色体上。已有几个应用植物RNA病毒作为载体的系统,在细胞质中表达反义RNA。Joshi等用萤火虫萤光素酶基因代替了大麦条斑病毒(BSMV)RNA β的开放读码框b,并且在转染烟草和玉米原生质体时表达;Donson等用一个以TMV为基础的载体来产生细菌新霉素磷酸转移酶(NPT II)。Chapman等应用马铃薯病毒X(PVX)为载体,表达了β-葡萄糖苷酸酶(GUS)。Dolja等把GUS插入到烟草蚀刻病毒(TEV)的多聚蛋白中,得到了表达。因此,在这样的系统中表达反义RNA是*可行的。刘博林等借助于Chapman等的PVX载体表达系统,在野生烟草(N. clevelandii)细胞质中成功表达了对应于plum pox virus(PPV)的反义RNA和酶性RNA。这为在细胞质中抑制RNA病毒的复制研究奠定了良好的基础。