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大白鼠肝DNA的提取与鉴定

发布时间: 2015-12-24  点击次数: 703次

一、目的 
掌握从动物组织中DNA基本原理和方法,了解利用电泳技术分离、鉴定核酸的原理和方法。 

二、原理 
真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于细胞核中,因此制备DNA必须先粉碎组织,裂解细胞膜和核膜,使核蛋白释放,在除去蛋白质、脂类、糖类和RNA等物质,得到纯化的DNA。在本实验的提取DNA反应体系中,SDS(十二烷基磺酸钠)破坏细胞膜和核膜,并使蛋白质变性,将核蛋白中的DNA与蛋白质分开,EDTA及SDS抑制细胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法进一步除去蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀除净小分子化合物。提取出的DNA制品进一步用含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳加以鉴定。 

三、材料 
(一)仪器 
研钵;研钵棒;刻度离心管;普通离心机;小试管;Ep管 
(二)试剂 
1、生理盐水 
2、裂解缓冲液 
3、苯酚:氯仿混合液(1:1) 
4、无水乙醇 
5、70%乙醇 
6、TE缓冲液 
7、溴酚蓝载样液 
8、溴乙锭溶液 
9、TBE缓冲液 

四、操作步骤: 
1、处死大白鼠,迅速取出大白鼠肝脏,用生理盐水洗去附着血液,用滤纸吸干血水后称量0.5g肝实质组织放于研钵中。 
2、研钵中加入1ml裂解缓冲液、少量石英砂,研磨至匀浆,再加入2ml继续研磨至匀浆。 
3、取刻度离心管一支,加肝匀浆至1.0ml,再加入等体积苯酚:氯仿混合液抽提,每次抽提以中等大小的力来回振荡5min,然后离心3000r/min,10min,水相吸入另一干净的小试管中,抽提重复3次『注1』。 
4、往乘有上水相的小试管中加入2.5倍体积的冷无水乙醇,轻轻混匀,此时可见有白色絮状沉淀,此即DNA粗制品。 
5、将试管中的上清液倒出,保留沉淀。用70%的乙醇洗涤沉淀2次,洗涤时动作要轻柔,同上法弃上清保留沉淀『注2』。 
6、加入0.25mlTE缓冲液溶解沉淀。 
7、取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。 
8、向Ep管中加入溴酚蓝载样液5ml,混匀后即为鉴定所用样品。 
9、取琼脂糖0.3g,TBE缓冲液15ml加入锥形瓶中,加热锥形瓶使琼脂糖充分熔解后,加入10ml溴乙锭,混匀后将胶液倒入已放置样孔梳的胶板上。 
10、待胶板凝好后拔去样孔梳,取15ml样品液加入样孔槽中。 
11、将加好样品液的胶板放入乘有TBE缓冲液的电泳槽中,样孔槽位于阴极侧,盖好电泳槽盖后通电,调节电压100V电泳40-60min。 
12、泳毕,拿出胶板,在紫外光灯下观察结果。 
『注1』吸水相时不要将界面上的变性蛋白质混入,抽提3次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少,肉眼基本看不见,若变性蛋白质仍较多,可增加抽提次数。实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短,并烧成钝口。 
『注2』zui后一次弃上清时,尽可能去尽上清。