重组质粒的筛选

实验仪器 控温摇床 水浴锅 冰箱（-20,‐70℃） 超净工作台 培养箱 
实验试剂 Amp LB IPTG X-Gal 
平皿 玻棒 三角瓶 离心管 移液器 tip 
实验步骤：20人／班 1平皿／人 
挑取可疑的白色菌落，移植于2mL的LB中，250转/分摇菌、37℃培养过。以快速碱法抽提质粒： 
1.取适量菌液于2ml指形管中，12000rpm/min 离心30s-1min。 
2.弃上清，且用滤纸吸干。 
3.加溶液I 100μL，重悬菌体（使细菌重新溶解）。振荡。 
溶液I：含葡萄糖，作用形成粘度和渗透压。 
含EDTA，作用是能络合Mg+、Ca ++，抑制DNA酶活性。 
含Tris-HCL，作用作为平衡盐。含溶菌酶，作用是溶解细胞壁。 
4.加溶液II 200μL，反复倒转轻摇。 
溶液II：含NaOH+SDS（现配现用）。作用：使溶液PH值达到12.4左右，使核酸变性，而质粒变性不严重。同时SDS能使蛋白质溶解。 
5.加溶液III 150μL，倒转轻摇匀。 
溶液III：含KAC、HAC其作用是使溶液PH达到中性，染色体退火形成网状，而质粒还原成螺旋状，溶解在水中。 
6.12，000r离心5分钟。 
7.转移上清至另一指形管。 
8.加等体积平衡酚（PH7.6以上，用Tris-NaOH调），猛烈摇匀， 12，000r离心5分钟。 
9.小心转移上清至另一指形管。 
10.加1/2体积平衡酚和1/2体积氯仿：异丙醇（氯仿：异丙醇为24：1），混匀，12，000r离心5分钟。 
11.重复9 
12.加等体积氯仿：异丙醇抽提，12，000r离心5分钟。 
13.重复9 
14.加1/10体积的3M NaAc（PH5.2）和2.5体积的无水乙醇，混匀。冰浴若干时间（时间可长可短）。NaAc使质粒（带负电）电荷减弱，易沉淀。 
15.12，000r，15分钟。 
16.弃上清，用75%乙醇1ml洗沉淀。作用：去盐。 
17.离心12，000r，5分钟。 
18.弃上清，风干残留液。 
19.加含有RNase的双蒸水30-50μL，溶解沉淀。 
20.室温作用若干时间，电泳检测或置冰箱结冰层备用。 
结果与分析: 
根据提取质粒酶切后的电泳图谱, 具体分析是否有插入片段; 有插入片段的为重组子.