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载体质粒的抽提、纯化及检测

发布时间: 2015-11-19  点击次数: 603次

一、目的:
了解质粒抽提常用的方法和原理;掌握试剂盒制备质粒dna 的法。
二、原理:
(一)质粒DNA 制备三个步骤:
1、细菌培养与质粒扩增
2、菌体收集和溶菌
3、质粒DNA分离
(二)方法介绍:
1、碱变性抽提法(SDS法):主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。染色体DNA 分子量比较大,在碱性环境中(高pH)变性,双链解拆开,抽提时由于机械剪切力的作用,环状断裂成线状,当pH 恢复中性时,无法恢复成环状,就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小,在碱性环境中(高pH),双链解旋,但不拆开,当pH恢复中性时,恢复成环状。由于分子量小,所以离心沉淀时,不下沉,保留在上清溶液中。
缺点:SDS 破细胞很厉害,小染色体片段和蛋白质比较多,后处理较困难。
2、酸酚法:主要是利用染色体DNA和质粒DNA 在酸性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。
染色体DNA 分子量比较大,在酸性环境中(低pH)变性,双链解拆开,抽提时由于机械剪切力的作用,环状断裂成线状,当pH 恢复中性时,无法恢复成环状,就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。
质粒DNA 分子量小,在酸性环境中(低pH),双链解旋,但不拆开,当pH恢复中性时,恢复成环状。由于分子量小,所以离心沉淀时,不下沉,保留在上清溶液中。
缺点: pH 值太低会降解DNA, pH 的适度难以掌握,稍一偏差,全部DNA 被降解,什么也没抽到。现不常用。
3、溴化乙锭-氯化铯(CsCl)梯度离心法:
1)不同的氯化铯浓度和不同的离心时间会成为不同的密度梯度。
2)抽提破细胞后,蛋白质,染色体DNA,质粒DNA,RNA 全部释放出来,加入溴化乙锭
(EB),通过EB对不同物质的插入多少而形成不同的密度梯度。EB插入越多,密度越小。离
心后,在离心管中从上到下(密度由小到大)形成的梯度区域带如下:

蛋白质(密度zui小)
染色体DNA(机械剪切力的作用断裂成线状,EB插入较多,密度较小)
质粒DNA-线状(EB 插入较多,密度较小)
质粒DNA-环状(EB 插入较少,密度较大)
质粒DNA-超螺旋(EB 插入少,密度大)
RNA(单链,EB 插入zui少,密度zui大)

不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用Cs-Cl 密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA 与蛋白质区分开来
优点:此法抽提的质粒DNA 高纯度。
缺点:1)要求的超速离心机。
2)成本高,氯化铯价格贵。

4.TritonX-100 抽提法:
TritonX-100为非离子极性剂,在溶液中不形成离子,破细胞比较温和。使用该试剂是为了破细胞时不要太激烈,只形成孔状破裂,使质粒DNA 释出(当然还有RNA和一些小片段的染色体DNA 和蛋白质),而不释出大片段的染色体DNA 。当离心时染色体DNA的大片段与细胞膜的网状碎片附在一起,与蛋白质一起被离心沉淀,而质粒DNA则留在上清。所以细胞膜破裂的程度是实验的关键。
然后使用苯酚与氯仿来祛除蛋白质。用无水乙醇沉淀回收质DNA。
优点:抽提的质粒比较纯,较好用, TritonX-100 不影响后续实验,可以大量抽提。
缺点:比试剂盒抽提时间要长