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真核细胞总RNA的提取与鉴定

发布时间: 2015-11-12  点击次数: 933次

RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是*的,也是zui常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA,但其中大部分为rRNA及由tRNA,而mRNA仅占1%~5%。虽然mRNA大小和序列各不相同,但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多腺苷酸链。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析。zui常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ,另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等。在所有RNA实验中,zui关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要zui大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其他分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 
一、防止rna酶污染的措施 
1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 
2.塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。 
3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。 
4.配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经 滤膜过滤除菌。 
5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 
6.设置RNA操作实验室,所有器械等应为。 
二、 常用的RNA酶抑制剂 
1.焦磷酸二乙酯 是一种强烈但不*的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的眯唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。 
2.异硫氰酸胍 目前被认为是zui有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。 
3.氧钒核糖核昔复合物由氧化钒离子和核昔形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能*抑制RNA酶的活性。 
4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。 
5.其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 
一、组织和细胞总RNA提取—异硫氰酸胍法 
【操作】 
1.样品处理 
(1)培养细胞 收集细胞1~2×107,离心,5000g×5min。对于贴壁培养细胞,用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后,PBS重悬细胞并转移至1Od离心管中;悬浮培养细胞可直接转移离心管;离心, 5000g×5mim PBS洗涤2次。弃上清,置冰浴。加预冷变性液2ml,充分摇动,使细胞裂解*。以下操作均在冰浴中进行。 
(2) 组织 取1~2g组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置组织匀浆器中,加入预冷的变性液12ml,在冰浴中充分匀浆。