地衣酚显色法测定RNA含量

【实验目的】 
掌握地衣酚显色法测定RNA含量的原理和方法 

【实验原理】 
RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的戊糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与地衣酚（3,5—二羟基甲苯）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有zui大吸收。当RNA浓度为20μg／m1~250μg／m1时，吸光度与RNA浓度成正比。 

【实验材料】 
1.实验器材 
恒温水浴,721分光光度计。 
2.实验试剂 
（1）RNA标准液：称取10mgRNA(需先定磷确定其纯度)用少量水溶解(若不溶可用2mol／L NaOH溶液调至pH7.0)，定容至100m1，浓度为100μg／ml。 
（2） RNA样品液：用上述实验方法提取的RNA样品 
（3） 地衣酚试剂：取0.1g地衣酚溶于100ml浓盐酸，再加入0.1gFeCl3·6H20。该溶液使用前新鲜配制。 

【实验操作】 
1．标准曲线的绘制 
取干燥试管6支，编号，按表所示加入试剂。
试剂
管号

0

1

2

3

4

5

RNA标准溶液，ml

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

蒸馏水，ml

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

地衣酚试剂，ml

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

A670

加样完毕后混匀，于沸水浴中加热20min，取出置自来水中冷却，以零号管为对照，670nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，RNA浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。 
2．样品测定 
取试管3支，两支为样品管，—支为空白管，在样品管中加入1.0m1样品液，再加3.0m1地衣酚试剂，混匀，置沸水浴中加热20min，取出冷却。空白管操作与标准曲线制作中零号管相同。以空白管调零点，于670nm处测吸光度，根据吸光度值从标准曲线上查出相应的RNA含量。 

【实验结果讨论】 
1．地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品中DNA含量，再算出RNA含量。 
2．本法较灵敏。样品中蛋白质含量高时，应先用5%三氯醋酸溶液将蛋白质沉淀后再测定，否则将发生干扰。 

【思考】 
配制地衣酚试剂时，为什么要加FeCl3，6H2O?