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士锋生物PCR技术:样品处理与注意事项

发布时间: 2015-09-21  点击次数: 469次

一、样品处理
  DNA是染色体的主要组成部分,是PCR的扩增模板。要进行PCR,研究DNA结构与功能或者用于诊断目的,首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在,其分子量大(人的染色体DNA平均大小为3.0×109bp),提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度,即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解,又要注意杂质及蛋白的去除,防止胞内酶解DNA。因此,提取DNA的基本过程是:用Proteinase K及SDS,在EDTA存在下,裂解细胞,消化蛋白质,使核蛋白解聚及胞内DNA酶失活,然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白质,在DNA中若混有少量RNA,可用RNase去除,zui后用乙醇沉淀得到DNA。

  理论上PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高,细胞经过热变性使DNA释出就可以作为模板,依赖引物的选择性进行扩增。这对拷贝数很多的基因组,确实如此。但当待扩增的拷贝数甚少而无关细胞甚多时则扩增就不易成功,其原因是:①非希望的扩增增多,掩盖了所需扩增的片段,使其数量减少至不能检测到的程度。②生物样品中的杂质会抑制pcr反应,zui主要的是血液和琼脂糖。例如在100μl反应液中加入1μl全血就可引起抑制,0.8μmol/L的血红素也会引起明显的抑制。对于含血液的样品,可以用渗透压溶解红细胞,离心集取细胞核,洗除血红蛋白,再用蛋白酶/表面活性剂处理的方法来解决。另一简单的方法是煮沸之,使释放DNA,并沉淀Hb,用上清液作PCR。

  现将PCR前处理各种标本的基本方法介绍如下:

  1.所需溶液

  (1)PBS 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

  (2)含表面活性剂及蛋白酶k的PCR缓冲液

  50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

  0.1mg/ml明胶,0.45%NP40,0.45%吐温20

  高压灭菌,冷冻储存。临用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。

  (3)溶血缓冲液

  0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-HCl pH7.5

  5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100