细胞吸附试验

一、材料和仪器
1.  海拉细胞（ATCC#CCL-2）

2.  96孔聚苯乙烯板（Fisher#07-200-91;Corning#3598）

3.  MTT细胞增殖试剂盒（ATCC#30-1010K）

4.  胶原I（Sigma-Aldrich#C7661）

5.  密理博（D-MEM）高糖培养基DMEM（Invitrogen#10313-021）

6.  胎牛血清（ATCC#30-2020）

7.  0.5 M EDTAsolution

8.  牛血清蛋白（Invitrogen#15561-020）

9.  PBS（Invitrogen#14190-144）

10.  37°C细胞培养孵育箱及5%CO2

11.  可以在吸收光570 nm 下使用96孔板测量的分光光度计。
 
二、步骤
1.  在含有10%FBS的DMEM培养基中培养细胞。

2.  制备含有40 μg/ml 胶原I的PBS溶液，4°C保存；含有0.1%BSA的DMEM。

3.  将96孔板每孔加入30 μl 胶原溶液覆盖，置于4°C。

4.  覆盖12小时后，去除胶原溶液，在组织培养罩中于室温下风干平板。

5.  在吸附试验前用血清去除细胞8小时，再用无血清的DMEM洗三次细胞。在DMEM中培养细胞。

6.  DMEM中加入EDTA使终浓度为10 mM，用以分离细胞。显微镜下观察细胞确保细胞*分离，分离过程需要约10分钟。

7.  用无EDTA的DMEM清洗细胞两次；用含有0.1%BSA的DMEM重悬细胞，使细胞在DMEM中的浓度为2×105cells/ml。

8.  为了进行细胞吸附试验，在用血清覆盖的96孔板的每孔中加入步骤7中的100 μl 细胞悬浮液。将平板置于37°C培养细胞20分
钟，使细胞附着在表面。

9.  每孔加100 μl DMEM洗掉没有附着的细胞，重复四次。

10.  注意：为保证实验的一致性，多板操作时可用排枪缓慢加入或移除DMEM。

11.  洗后，加入含有10%FBS的DMEM，37°C孵育细胞4小时。

12.  每孔加10 μl MTT底物，30°C孵育细胞2小时。

13.  MTT处理过的细胞会被裂解，用分光光度计在570 nm 检测溶液吸光值。

14.  注意：可以考虑加入下列对照组来检测每一步实验：没有用胶原I覆盖的96孔板；没有用DMEM洗的96孔板；没有加细胞的96
孔板；没有加MTT的96孔板。