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PCR各处应用模式

发布时间: 2017-08-16  点击次数: 667次

一、兼并引物(Degenerate primerPCR
密码子具有兼并性,如表22-4,单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不的,但可以设计成对兼并引物,扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变,但核苷酸的数量应相同。兼并度越低,产物特异性越强,设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸,并避免引物3’末端兼并,针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳动物与禽类的嗜肝病毒基因。用脱氧肌苷(deoxyinosineDI)引物进行PCR,可以代替编码蛋白的多种兼并密码子中的兼并碱基,DI的特异性主要受cDNA浓度影响。

22-4 密码兼并性

氨基酸

密码子数

MW

1

CDEFHKNQY

2

I

3

AGPTV

4

LRS

6

注:选择使用的肽链避开有46个密码子的氨基酸

二、套式引物(Nested PrimerPCR

用*套引物扩增1530个循环,再用扩增DN片段内设定的第二套引物扩增1530个循环,这样可使待扩增序列得到扩增,而次级结构却很少扩增。用起始引物*或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心,在第二套引物加入前去除*引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gptguanine phosphribosy transferase)基因,与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火,从而增加了特异性扩增,提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。

若将套式PCR的内外引物稍加改变,延长外引物长度(至2530bp),同进缩短内引物长度(1517bp),使外引物先在高温退火温度下做双温循环扩增,然后改换至三温循环,使内引物在外引物扩增的基础上作低温火温度的三温循环直到扩增完成,这样就可以使两套引物一次同时加入,两种循环一气呵成,等于只做一次PCR,而灵敏度与套式二次PCR无异,在我们zui近推出的PTc 51气流式DNA热循环仪上就可以完成全部程序。

套式一次PCR的成功,使pcr检测的全过程可以在5h内完成,使当天出检验报告成为现实,也使PCR检测走入临床有了现实的基础。

三、复合PCRMultiplex PCR

用多对引物同时扩增几条DN片段的方法称为复合PCR。这一方法zui初是由Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时PCR扩增的检测方法。两种不同的军团菌(legionella)基因,一为特异嗜肺L基因(mip),另一种为L-5SrRNA基因,通过引物摇摆(staggered)添加进行复合PCR。首先mip引物PCR扩增7个循环,然后加入5SrRNA引物PCR扩增38个循环。加入不同量的LacZLacB基因引物进行PCR扩增可以检测大肠杆菌和与人类粪便污染有关的细菌包括E.coli大肠菌、肠源致病沙门氏菌和志贺氏菌。