真核细胞基因的转染方法

【1】．DEAE－葡聚糖法 
一、实验材料： 
1．50mg/ml DEAE-葡聚糖溶液（500mg DEAE-葡聚糖溶于10ml水，1ml分装，高压灭菌，储存于-20℃） （Sigma） 
2．TBS溶液(PH 7.4) 
NaCL 8.0g/L 
KCL 0.2g/L 
Tris 3.0g/L 
酚红 0.015g/L 
(HCL调PH至7.4，定容1L。高压灭菌。) 
3．20％葡萄糖溶液(高压灭菌，-20℃储存) 
4．PBS (PH 7.4) 
二、实验方法： 
1．配置TBS-D溶液 
100mlTBS加入20％葡萄糖溶液0.5ml，至终浓度为1％。 
2．配置DEAE-dextran-DNA-TBS-D转染液 
DEAE-dextran 1mg/ml 
DNA(超螺旋) 5-10ug/ml(DNA浓度根据细胞种类、细胞密度及质粒种类决定，zui适浓度经预实验确定) 
转染液数量根据细胞多少决定，一般每瓶细胞需300ul。 
3．以5×105/瓶密度接种细胞，培养24小时。 
4．细胞弃培养基, PBS 5ml洗两遍, TBS-D洗一遍，吸尽残液。 
5．加入转染液，摇动培养瓶，使其与细胞充分接触，放入孵箱温育20－40分钟，观察细胞至皱缩变圆为止。 
6．吸去转染液，TBS-D洗两遍, PBS洗一遍（动作必须轻柔，避免已转染DNA的细胞脱落），加入10ml全培养基 3％CO2浓度37℃培养。 
三．实验结果鉴定标准： 
1．转染有DNA的细胞一般镜下观察颗粒较多，加入抗生素筛选培养，可使未转染DNA的细胞死亡。 
2．如目的DNA为pZ189，可通过Hirt’s法提取，做转化鉴定。 
3．加入氯喹作用或进行甘油休克可增加转染效率。 
四．参考文献： 
1．Sambrook J et al. Molecular cloning. 
2．张小山，浙江医科大学研究生学位论文。