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真核细胞基因的转染方法

发布时间: 2017-07-10  点击次数: 768次

【1】.DEAE-葡聚糖法 
一、实验材料: 
1.50mg/ml DEAE-葡聚糖溶液(500mg DEAE-葡聚糖溶于10ml水,1ml分装,高压灭菌,储存于-20℃) (Sigma) 
2.TBS溶液(PH 7.4) 
NaCL 8.0g/L 
KCL 0.2g/L 
Tris 3.0g/L 
酚红 0.015g/L 
(HCL调PH至7.4,定容1L。高压灭菌。) 
3.20%葡萄糖溶液(高压灭菌,-20℃储存) 
4.PBS (PH 7.4) 
二、实验方法: 
1.配置TBS-D溶液 
100mlTBS加入20%葡萄糖溶液0.5ml,至终浓度为1%。 
2.配置DEAE-dextran-DNA-TBS-D转染液 
DEAE-dextran 1mg/ml 
DNA(超螺旋) 5-10ug/ml(DNA浓度根据细胞种类、细胞密度及质粒种类决定,zui适浓度经预实验确定) 
转染液数量根据细胞多少决定,一般每瓶细胞需300ul。 
3.以5×105/瓶密度接种细胞,培养24小时。 
4.细胞弃培养基, PBS 5ml洗两遍, TBS-D洗一遍,吸尽残液。 
5.加入转染液,摇动培养瓶,使其与细胞充分接触,放入孵箱温育20-40分钟,观察细胞至皱缩变圆为止。 
6.吸去转染液,TBS-D洗两遍, PBS洗一遍(动作必须轻柔,避免已转染DNA的细胞脱落),加入10ml全培养基 3%CO2浓度37℃培养。 
三.实验结果鉴定标准: 
1.转染有DNA的细胞一般镜下观察颗粒较多,加入抗生素筛选培养,可使未转染DNA的细胞死亡。 
2.如目的DNA为pZ189,可通过Hirt’s法提取,做转化鉴定。 
3.加入氯喹作用或进行甘油休克可增加转染效率。 
四.参考文献: 
1.Sambrook J et al. Molecular cloning. 
2.张小山,浙江医科大学研究生学位论文。