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酸性磷酸酶(ACP)的显示实验

发布时间: 2017-03-27  点击次数: 865次

目的要求 
1.熟悉酸性磷酸酶显示方法的原理及操作步骤 
2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布

基本原理
酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)主要存在于巨噬细胞,定位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时,底物不易渗入,ACP活力微弱或无活性,经固定,在合适pH条件下,膜本身变为不稳定,逐渐改变其渗透性,底物可以渗入,酶活力被显示。

ACP在酸性条件下(pH4.7)可使作用液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离出来,进而与溶液中*结合形成磷酸铅沉淀,因其是难溶解的无色沉淀物,需要与黄色的硫化铵作用,生成棕黑色PBS沉淀而被显示出来。
β-甘油磷酸钠→甘油+PO3-
PO4 +Pb(NO3)2→ Pb2(PO4)2
Pb2(PO4)4 +(NH4)2S→PbS

实验用品
1.器材:注射器、解剖用具、恒温水浴锅、载玻片、盖玻片
2.试剂:
3%淀粉溶液;ACP作用液;2%硫化铵
3.材料:小鼠腹腔液涂片

免疫动物:实验前4~6天用无菌注射器取已灭菌的3%淀粉溶液1ml注射于小鼠腹腔内,每天一次。
酸性磷酸酶(ACP)的显示

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酸性磷酸酶(ACP)的显示

吸取少量腹腔液,在玻片上涂层一薄层,室温晾干。
酸性磷酸酶(ACP)的显示

将涂片滴置于温盒中,滴加适量ACP作用液,37℃作用30分钟。取出后,蒸馏水漂洗。用10%甲醛钙溶液后固定5min。
酸性磷酸酶(ACP)的显示