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目的基因克隆的筛选与鉴定

发布时间: 2017-03-08  点击次数: 2383次

目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是的,因而zui后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA,一个细胞只接受一个重组DNA分子。zui后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体(recombinant)。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆,所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载体,选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。以下就常用技术的基本原理加以介绍。

一、根据重组载体的标志作筛选
zui常见的载体携带的标志是抗药性标志,如抗氨芐青霉素(anpr)、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时,只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖,这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活,这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因,若将目的序列插入terr基因序列中,转化大肠杆菌,让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中,凡未接受质粒dna的细胞都不能生长;凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的,但其pBR322未插入目的序列,凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。
载体含有lacZ"的蓝白筛选法,近年更被广泛应用。例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点,转化大肠杆菌,放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养,凡能生长并呈白色的菌落,其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒,这样就很容易获得目的序列的克隆。

根据重组载体的标志来筛选,可以筛选去大量的非目的重组体,但还只是粗筛,例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变,却并不代表目的序列的插入,所以需要做进一步细致的筛选。

二、核酸杂交法
利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交,可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上,用碱裂菌,菌落释放的DNA就吸附在膜上,再与标记的核酸探针温育杂交,核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记,结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影(auroradiography)法指示出来,核酸探针也可以用非放射性物质标记,通常是经颜色呈现指示位置,这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。

三、PCR法
PCR技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列,则可以设计合成一对引物,以转化细胞所得的DNA为模板进行扩增,若能得到预期长度的PCR产物,则该转化细胞就可能含有目的的序列。