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细胞骨架系统的显示和观察

发布时间: 2017-02-06  点击次数: 924次

细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构,主要包括微管(microtubule,MT,20~25 nm)和纤丝(filament)两大类;另外,胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同,纤丝又可分为微丝(microfilament,MF)、中间丝(intermediate filament,IF)和粗丝(thick filament,TF)三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维(F-actin),直径为6~7 nm,又名肌动蛋白丝,其长度不定,多分布在近细胞膜的下方。微丝在不同种类的细胞中,它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构,如张力纤维(stress fiber)、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用普通光镜观察到细胞骨架,是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后,有夸大作用。由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分,使得显现更清晰。 
细胞骨架在通常情况下不稳定:如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时,能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质,而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰,M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性,戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分,经考马斯亮蓝R250染色后,可使细胞骨架蛋白着色,而胞质背景着色弱,有利细胞骨架纤维显示。 
1.实 验 目 的 
1.1. 掌握考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250)染细胞胞质微丝的方法。 
1.2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。 
2.实 验 原 理 
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料,它可以使各种细胞骨架蛋白质着色,并非特异地显示微丝,但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定,例如微管;还有些类型的纤维太细,在光学显微镜下无法分辨,因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维,直径约40nm左右。张力纤维形态长而直,常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段,本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。 
染色时用的M-缓冲液,其中咪唑是缓冲剂,EGTA和EDTA螯合Ca2+离子,溶液中并提供Mg2+离子,在此低钙条件下,骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。 
3.实 验 用 品 
3.1 材料 洋葱鳞茎内表皮细胞或培养的成纤维细胞。 
3.2 试剂 
3.2.1. 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法 
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3) 50 ml 
NaCl 0.15 mol/L 
重蒸馏水 至1000 ml 
其中PB的配法: 0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml 
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml 
3.2.2. M-缓冲液 
咪唑(imidazole, pH6.7) 50 mmol/L 
KC1 50 mmol/L 
MgCl2 0.5 mmol/L 
EGTA l mmol/L 
EDTA 0.l mmol/L 
巯基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L 
甘油 4 mmol/L 
用1 mol/L HCl调pH至7.2。