植物原生质体融合

一、目的与要求 
了解植物原生质体融合的基本原理及其过程。 
二、基本原理 
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合。现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二烯（PEG）法、高Ca高pH法和电融合法。 
PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随和用高Ca高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。 
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化集团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2＋等阳离子。Ca2＋可在一些负极化基才和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。 

三、实验内容 
1．原生质体分离 
2．原生质体融合 
3．融合体的识别 

四、实验步骤 
1.溶液的配制 
（1）酶液 
1％纤维素酶 
1％果胶酶 
0.7mol甘露醇 
0.7m mol碳酸二氢钾 
10m mol二水合氯化钙 
pH6.8~7.0 
（2） PEG融合液 
40% PEG (MW1500－6000) 
0.3 mol 葡萄糖 
3.5m mol 二水合氯化钙 
0.7mol 碳酸二氢钾 
(3) 13%CPW洗液 
27.2 mg/L碳酸二氢钾 
101.0 mg/L硝酸钾 
1480.0 mg/L二水合氯化钙 
246.0 mg/L七水合硫酸镁 
0.16 mg/L碘化钾 
0.025 mg/L五水合硫酸铜 
13% W/V甘露醇 
pH 6.0 
（4） 20％蔗糖溶液 
2.原生质体的分离 
将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。用200目网过滤除去未*消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心2分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20％蔗糖溶液上（5ml离心管装3ml20％蔗糖溶液），在1000rpm条件下离心5～10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体悬浮在20％蔗糖溶液与13％CPW溶液之间，破碎的细胞残渣沉于管底。 
用200ml的移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加入4ml13％CPW洗液，1000rpm离心2分钟，弃上清，用血球计数板调整原生质体密度为105－106之间。 
1. 原生质体融合 
将1～2滴原生质体混和物（密度为105－106之间）滴入小培养皿（或载玻片上），静置8～10分钟，相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1ml和2ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、第三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能洗干，否则原生质体破碎死亡。zui后用培养基洗1～2次即可进行培养。 
2. 观察 
两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合，核融合通常于融合体*次有一次分裂过程中发生。