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细胞组分的化学反应

发布时间: 2016-09-26  点击次数: 463次

细胞的组织化学方法,是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应,从而在细胞局部形成有色沉淀物,再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。 一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA (一)原理 细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后,其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应,一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力,且这两种染料的作用有选择性,甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色,呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。 (二)方法 l.接种Hela细胞于盖片上并培养24~48小时,使长成单层。 2.取出盖片,用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。 3.放入Carnoy固定液中固定l小时。 4.浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。 5.取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2~3次(2~3秒钟左右),吸去水分。放入纯丙酮中分色2~3秒钟。 6. 放入l/2丙酮+1/2二甲苯中5秒钟。 7.放入纯二甲苯中透明5分钟。8.滴一滴中性树胶于载玻片上,将盖片标本面朝下封片。9.镜下观察(三)结果细胞质被染成浅红色,细胞核被染成蓝绿色,而其中核仁被染成紫红色。二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示(一)原理由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同,在pH值不同的溶液中,蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下,整个蛋白质所带负电荷多,则为酸性蛋白质;带正电荷多,则为碱性蛋白质。据此,可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后,用不同pH值的固绿染液分别染色,细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。(二)方法1.以破坏脊髓法处死蟾蜍,将其腹面向上放人蜡盘中,剪开胸腔,打开心包。小心将心脏剪一小口,取心脏血一滴滴在干净载玻片一端,推片,按此法制备二张血涂片,室温晾干。2. 将涂片作好标记放在70%乙醇中固定5分钟,室温晾干。3.放入5%三氯醋酸中60℃30分钟,抽提出核酸。4.清水冲洗多次(3分钟以上),以冲去痕迹的三氯醋酸。5.滤纸吸干玻片上水分。6. 一张片放入0.1%碱性固绿(pH8.0~8.5)中染色10~15分钟,另一张片放入0.1%酸性固绿(pH2.0~2.5)染色5~10分钟。7.清水冲洗,盖上盖片镜检。(三)结果经碱性固绿染色片中,胞质、核仁不着色,细胞核大部分被染成绿色,是为碱性蛋白质存在处。经酸性固绿染色片中,因胞质和核仁中有酸性蛋白,被染成绿色。 三、细胞内过氧化物酶的显示(一)原理过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物,用联苯胺处理标本,细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝,进而变为棕色产物,因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。(二)方法1.取小鼠一只,以颈椎脱位法将其处死,迅速剖开其后肢暴露出股骨,将股骨一端斜向剪断,用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。2.推片,室温晾干。3.将涂片放入0.5%硫酸铜中浸30秒~1分钟。4.取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。5.清水冲洗,放入1%番红溶液中复染2分钟。6.清水冲洗,室温晾干。7.镜检或封片后镜检。(三)结果涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒,为过氧化物酶所在位置。 四、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原 (一)原理 组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示,其化学基础是利用过碘酸的氧化作用,打开碳链形成醛,生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。 (二)方法 l.取l~2mm厚的肝组织块,用Carnoy氏液4℃固定4~6小时。 2.乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋,切片。 3.用70%乙醇展片。 4.脱蜡:二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100%乙醇5分钟→含1%火棉胶的乙醇液1分钟→70%乙醇1分钟。 5.直接浸入过碘酸酒精液反应5~15分钟,经70%乙醇洗片刻。6.浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。 7.亚硫酸水洗三次,以洗去多余的非特异性结合的色素,以及扩散的染料。 8.流水冲洗3~5分钟。 9.蒸馏水洗。 10.浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒,使细胞核着色。 11.脱水:95%乙醇3分钟二次→100%乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。 12.加盖片镜检或树胶封固后镜检。 (三)结果 细胞中呈紫红的颗粒即为糖原。