新闻资讯 / news 您的位置:网站首页 > 新闻资讯 > 如何用S1核酸酶对RNA作图
产品分类

Product category

如何用S1核酸酶对RNA作图

发布时间: 2016-08-08  点击次数: 1056次

用s1核酸酶对RNA作图

三种不同的核酸酶——S1核酸酶、rna酶、外切核酸酶Ⅶ被用来进行RNA定量,确定内含子位置,以及用来鉴定在克隆的DNA模板上的mRNA 5′端和3′端的位置。当检测RNA被杂交到DNA模板上时,用核酸酶S1进行保护试验的分析;当检测RNA被杂交到来自DNA模板的RNA上时用RNA酶。外切核酸酶Ⅶ有更专一的用途——对短的内含子作图并解决S1核酸酶保护试验中出现的异常情况。

这三种酶的使用方法是Berk和Sharp(1977)提出的经典S1核酸酶保护试验技术的改良。含有目的mRNA的RNA样品与互补的DNA或RNA探针在利于形成杂合体的条件下温育。在反应的末期,一种酶用来降解未杂合的单链RNA和DNA。剩下的DNA-RNA或RNA-RNA杂合体用凝胶电泳分离,接着用自显影或southern杂交来观察。当探针的摩尔数在杂交反应中过量时,信号的强度和样品中的目的mRNA的浓度成正比。用过量探针与一系列定量靶序列杂交作出标准曲线,从而准确估算样品浓度。S1核酸酶保护试验的zui初模式中一个主要的问题是用双链DNA作为探针。为防止探针DNA在杂交一步重新结合,理想的情况是建立有利于形成RNA-DNA杂合体远甚于形成DNA-DNA杂合体的反应条件,但并不总是可行。因为DNA-RNA杂合体比DNA-DNA杂合体略微稳定,复性条件一般是含80%甲酰胺、温度高于双链DNA熔点的计算值。然而,在这种条件下,杂交速度降低约10倍,而且DNA-RNA杂体产物的稳定性也不确定。使用单链探针则可以解决这些问题。复性可以在正常的杂交条件下进行,因为没有互补的单链和靶RNA竞争探针。但是当Berk和Sharp进行研究时,还没有可靠的方式去除其互补部分的单链DNA。链分离凝胶电泳是那时惟一可行的方式,但它始终是一种技巧性很强、难于掌握的技术。只有70%的DNA片段可以得到分离,而且即使在相当成功的条件下,样品中也不可避免的污染互补DNA单链。直到20世纪80年代后期,通过制造有高度特异活性的标记单链DNA或RNA探针才解决了这一问题。

S1核酸酶保护试验中使用的探针通常是由双链DNA两条链分离得到的,已知极性且特异性高。或者更普遍地,从头合成与双链DNA模板的一条链互补的RNA或与单链模板互补的DNA。

链分离的探针通过同时或依次使用两种Ⅱ型限制性内切核酸酶预处理,产生在5′端和3′端各有一段突出的合适大小的DNA片段(通常100~500个核苷酸)。因此该片段的一条链zui多可以比另一条链长8个核苷酸。在变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳已足够分离这种差异的两条链。在电泳前或电泳后,目的单链的5′端被去磷酸化并从[γ-32P]得到标记的磷酸基团,从而在体外被标记,T4噬菌体多核苷酸激酶催化这一反应。

从头合成探针法用来体外产生末端标记或均匀标记的DNA探针。末端标记的探针通过将寡核苷酸引物的5′端磷酸化而得到。均匀标记的探针通过放射标记的核苷酸引入正在合成的DNA单链得到。在两种情况下,通过一种可识别新合成的双链DNA上特异位点的限制性酶酶切,分离新合成的DNA链和模板。接下来可以用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离放射性标记的探针和线性化的单链DNA。

当一种引物浓度是另一种的20~200倍时,pcr反应严重偏听偏向于合成只和DNA其中一条链作用的放射性标记探针。当PCR反应刚开始的几个循环里,双链DNA以普遍的指数形式合成。然而,当一种引物的浓度受*,反应以算术速度产生单链DNA。到反应结束时,DNA某一条链的浓度比另一条多3~5倍。

通过双链DNA模板和仅一种引物的热循环反应合成*只含DNA一条链的放射性标记的探针。经过40个循环,双链模板DNA(20 μg)产生约200 μg的单链探针。探针的长度可以通过在模板DNA探针结全位点的下游选取酶切位点加以限定。

通过转录连在噬菌体启动子上的线形双链DNA模板,可以产生均匀标记的RNA探针,即核糖核酸探针。通过在重组质粒克隆的DAN序列中或其下游选取酶切位点酶切可以得到DNA模板,也可用PCR扩增模板。线形化的模板在[γ-32P]NTP存在的条件下由合适的噬菌体来源的依赖DNA的RNA聚合酶转录,产生长度为从模板DNA片段启动子的起始位点到其终点的标记的RNA。启动子和DNA序列按照一定的方向排列,从而使得到的核糖核酸探针与待分析的mRNA是反义(互补)。严谨的但并非必须的后续工作是用变性琼脂糖凝胶电泳纯化RNA探针。纯化可以用微型凝胶模子里配制的5%聚丙烯酰胺凝胶-8 mol/l尿素体系以及微型蛋白凝胶装置中简易快速的执行。

即使使用单链探针,用S1核酸酶分析真核RNA结构还是会有假象。例如,DNA:RNA杂合双链中微小的不配对就会对S1核酸酶有抗性。相反地,富含rU:dA序列的配对的杂合双链区容易受到酶切。一条单链DNA分子如果同时和两条不同的RNA分子杂交,则可以不被核酸酶作用。zui后一点,S1核酸酶不能有效地切割与RNA突出环相对的一段DNA。大多数这些问题可以用改变S1核酸酶浓度、采用不同酶切浓度、使用不同的核酸酶(如绿豆核酸酶)、使用几种核酸酶组合(如RNase H和S1核酸酶)来解决。但是注意的是,用S1核酸酶作用于两种核酸并不一定能反映出差异,而不被消化的两条核酸也不一定相同。用S1核酸酶绘制mRNA 5′端和3′端图谱,很得要的一点是要用独立的技术如引物延伸来加以验证。

在许多作图实验中,绿豆核酸酶可以替代S1核酸酶。当和DNA探针一起使用时,完成单链区*酶切所需的绿豆核酸酶远少于S1核酸酶。例如,酶切对应于人低密度脂蛋白受体的过量的单链DNA探针需要S1核酸酶达到1000 单位/ ml可完成*酶切,而绿豆核酸酶只需要10 单位/ ml就可达到相同的结果。绿豆核酸酶的生个缺点是在单位碱基上的用量比S1核酸酶多20倍。在下述实验方案中,绿豆核酸酶可以在第22步替代S1核酸酶。绿豆核酸酶消化作用的缓冲液:10 mmol/l醋酸钠(pH 4.6)-50 mmol/l NaCl-1 mmol/l ZnCl-1 mmol/l β-硫基乙醇-0.001%(V/V)Triton X-100。