新闻资讯 / news 您的位置:网站首页 > 新闻资讯 > 回收.连接.转化.克隆.测序
产品分类

Product category

回收.连接.转化.克隆.测序

发布时间: 2016-07-18  点击次数: 965次

目标片断回收后立即与pGEM-T载体做连接反应。反应体系:2X连接buffer 5μl,回收产物 3μl,T载体 1μl,T4连接酶 1μl,共10μl;混匀,4℃放置16小时以上

转化:

1、从-70℃冰箱中取40μl感受态细胞悬液,冰上解冻。

2、 加入连接产物1-2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置25分钟后。(38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受态)。

3、42℃水浴中热击45秒,热击后迅速置于冰上冷却2分钟。

4、向管中加入0.6ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

5、在加有氨苄的琼脂糖平板上预加40μl的X-gal和4μl的IPTG,推棒涂匀,放置10min让其充分吸收

6、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液*被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

7. 培养12小时后,挑选圆润的菌落转入另一个预加有40μl X-gal和4μl IPTG并划分不同区域的平板上,37℃培养8小时。

阳性克隆的鉴定:

做菌落PCR挑选阳性克隆:在反应管中加入8μl无菌水,挑选单个菌落入管中,加10μl矿物油封住液面,95℃反应5min。结束后在每管中加入除模板外的其他反应体系,用量与反应条件与扩增相同。挑选电泳结果好的测序。

注意事项

同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。

1.将感受态细胞加入要转化的东东(一般原则是转化物体积不超过感受态细胞体积的十分之一)。冰上置半小时。

2.热休克:42度,时间30秒至120秒都可以。一般书上都是90秒。

3.复苏:热休克后加入4倍体积的无抗生素培养基SOC(如果嫌麻烦,LB也可),37度摇一小时。转速低于220转/分钟。

4.涂板:4000转离心2-3分钟,多余上清不要,留约200UL将菌液混匀,推平板,直到菌液基本涂干。37度孵箱放12-16小时。