新闻资讯 / news 您的位置:网站首页 > 新闻资讯 > 如何成功做好DNA酶切
产品分类

Product category

如何成功做好DNA酶切

发布时间: 2016-06-30  点击次数: 2817次

1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性),不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的 EDTA (TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。

2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。

3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长tip, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意:酶通常是zui后加。

4) 反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以了。

5) 模板浓度问题:浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会好。浓度过低,也会影响酶活性。

6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。

7) 酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。

8) 反应温度的选择。一般反应都用37度,但是 Sma I 的温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如taq I的zui适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的1/10。

9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要*酶切可以采用少量的酶长时间反应,或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的zui终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过1ul。

10) 是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段:加入高浓度的EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于zui适的反应温度比较高,热处理灭活不一定*,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。

2.如果遇到酶切不动或切不*,该怎么办?

要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们多次接到这样的问题:1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切*? 从下面几个因素去考虑:

1) 酶是否有活性:酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。我们公司销售的SibEnzyme公司的酶,在分装前严格检验过,不合格的东西(很少)都退回原厂,所以不合格的产品是不会送到用户手头的。

2) 模板性质是否清楚:如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质(线状,超螺旋状)、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA*酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的),同时需要提高酶的用量(10U/ug)和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的,背景不清楚也造成困惑。

1.如何做好酶切?

该问题看似什么简单: DNA中加上酶,然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中,我们不断听到:切不动,装不上。问题在什么地方?能系列生产限制性内切酶的公司上,就那么几个,位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题,但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。

1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性),不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的 EDTA (TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。

2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。

3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意:酶通常是zui后加。

4) 反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以了。

5) 模板浓度问题:浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会好。浓度过低,也会影响酶活性。

6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。

7) 酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。

8) 反应温度的选择。一般反应都用37度,但是 Sma I 的温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如Taq I的zui适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的1/10。

9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要*酶切可以采用少量的酶长时间反应,或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的zui终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过1ul。

10) 是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段:加入高浓度的EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于zui适的反应温度比较高,热处理灭活不一定*,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。

2.如果遇到酶切不动或切不*,该怎么办?

要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们多次接到这样的问题:1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切*? 从下面几个因素去考虑:

1) 酶是否有活性:酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。我们公司销售的SibEnzyme公司的酶,在分装前严格检验过,不合格的东西(很少)都退回原厂,所以不合格的产品是不会送到用户手头的。

2) 模板性质是否清楚:如果 DNA的类型变了所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质(线状,超螺旋状)、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。对超螺旋状DNA*酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍(在我们的目录上有部分酶是有标注的),同时需要提高酶的用量(10U/ug)和延长反应时间等措施。还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的,背景不清楚也造成困惑。

3) 模板纯度是否够:模板制备方式影响DNA的质量,制备过程中使用到乙醇,氯仿,苯酚,SDS, EDTA等如果残留在zui终的DNA模板中,都会不同程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提,需要的问题污染是变性剂和乙醇;如果是手工制备的,氯仿,乙醇,苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。

4) 甲基化程度对酶的活性是否有影响:细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式,在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细看看使用的酶对甲基化的敏感情况,或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。

5) 反应条件是否合适:对照说明书,检查使用的温度是否正确,是否需要添加BSA, 是否使用正确的缓冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。注意有些研究人员将buffer长时间放在4度或室温,这是很不规范的行为。

6) 酶稀释和添加方式是否正确:一般要求在zui后加酶,但是对同时做多个相同反应的时候,zui后加酶有可能不很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物,然后分装,zui后加模板。需要提醒的是混合物(Master Mix)中由于没有底物的存在,离子强度也不对,酶可能要受到损伤。这种提前混合的做法没有问题,只是动作要快一些,没有分装前的Mix,要求放在冰里,尽快使用。

3.如何设定PCR引物的保护碱基?

如果您想直接对PCR产物酶切,同时想获得理想的酶切效果,一般情况下需要在酶切位点序列5’端方向增加额外的保护碱基。保护碱基的数目随酶的种类不同而不同,根据文献资料汇总,一般保护碱基有3-4个就可以了。不提倡提供过多的保护碱基,因为太多的额外碱基会增加PCR扩增的难度,同时增加合成费用。

4.如何对PCR扩增的产物进行酶切?

Fermentas公司的研究表明,限制性内切酶在 PCR扩增体系中仍然有部分活性,可以通过稀释(3倍以上)扩增混合液,适当提高酶量和反映时间,进行酶切。我个人认为需要对PCR产物进行酶切分析通常是为了或基因表型分析,由于Taq,Pfu等高温聚合酶在酶切温度(37度或更高)下,仍然保持一定的活性,高温聚合酶所具有的聚合或无模板添A或外切修正的功能仍在一定的程度上表现出来,可能会影响到酶切产物末端的正确性。结果是要么装不上去,要么装上去切不下来,测序发现末端引物碱基少了。正确安全的做法是先通过琼脂糖电泳回收产物,然后酶切,酶切可以适当提高酶的用量。一般的做法是从50ulPCR反应中回收的产物,溶解于45ul水中,加入酶,酶切后的产物通过从溶液中回收DNA的方式直接回收,不需要跑琼脂糖电泳。