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利用随机扩增多态性DNA 指纹技术对猪链球菌进行基因分型

发布时间: 2016-05-30  点击次数: 481次

猪链球菌病是由链球菌感染引起的猪的一类疾病的总称。随着我国工厂化养猪业的不断发展,猪链球菌病已成为危害养猪业的一种重要疾病。该病一年四季均可发生,侵害不同年龄的猪,由于链球菌血清型多、抗原结构复杂,在临床上可呈现不同的特征,如败血症、脑膜脑炎、心内膜炎、肺炎、化脓性淋巴结炎、关节炎、支气管肺炎等,还常与其他疾病合并感染,发病率和死亡率较高 稍加改进。
1. 4. 2 RAPD 反应条件优化及引物筛选 利用100 条随机引物对20 株猪链球菌基因组DNA 进行随机扩增,将结果稳定且有多态性的引物用作RAPD 分析。根据文献报道,大致确定各组分的浓度后对各组分和反应条件逐个进行优化,确定其*浓度和扩增反应条件。主要优化了对RAPD 影响较大的2 个反应参数,即PCR 反应体系中的Mg2 + 浓度(1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4.0、4. 5 mmol/ L) 和DNA 模板浓度(10、50、80、100、120、150、200 ng/μL) 。反应体系为25μL ,内含1. 5 U Taq 酶、10 mmol Tris2HCl 缓冲液(pH 8. 0) 、50 mmol KCl、0. 1 mmol dNTP 及8 pmol 随机引物。PCR 反应液覆盖25μL 矿物油后进行扩增。94 ℃预变性5 min ,然后94 ℃反应1 min ,35 ℃反应1 min ,72 ℃反应2 min。40 个循环后72 ℃保温20 min ,以使延伸反应充分完成。取15μL 扩增产物用15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果。
1. 4. 3 RAPD 指纹图谱分析 以所有分析菌株为变量,不同的扩增产物为样本,统计扩增结果。以遗传距离为聚类统计量,采用zui小距离法,经SPSS 10. 0 软件统计出各菌株的欧氏遗传距离,并进行聚类分析,绘出亲缘关系树状图。

2 结果
2. 1 RAPD 随机引物筛选及反应条件的优化
在100 条随机引物中有68 条引物有扩增产物,其中10 条引物为单态性,27 条引物多态性较好。在RAPD 条件优化中,发现Mg2 + 在2. 5 mmol/ L 时有较高的扩增效率,且非特异性低; 当Mg2 + 浓度降低时,扩增效率随之降低;Mg2 + 浓度过高,非特异性扩增增强。DNA 模板浓度在50 ng/μL 时有较好的扩增结果,当浓度较高时,扩增条带模糊不清,甚至出现涂抹带。
2. 2 RAPD 结果
100 条引物中,有32 条引物无法扩出稳定的带型或无扩增产物。其中27 条引物可分别产生3~12 条片段,表现出较高的多态性,能应用其分析的猪链球菌种内的遗传差异,从而对其分型。扩增结果如图1 和图2。
利用随机扩增多态性DNA 指纹技术对猪链球菌进行基因分型 
图1 引物OPO20 扩增结果
1~20 为试验时的菌株编号,M为Marker
利用随机扩增多态性DNA 指纹技术对猪链球菌进行基因分型
图2 引物OPM04 扩增结果
1~20 为试验时的菌株编号,M为Marker