1、用Buffer A 洗涤
2、500G离心5分钟
3、用BufferA+B(2:1)裂解细胞,轻轻混匀,孵育5-10分钟
4、12000G离心10分钟(上清:细胞质。沉淀:细胞核和细胞膜)
5、PBD洗涤细胞两次,12000 G离心10分钟
6、Buffer C裂解细胞膜(放入液氮中快速冷冻,在冰上融化10分钟)
7、12000G离心10分钟(上清:细胞核。沉淀:细胞膜)
8、用PBS洗涤
9、用PRPA Buffer在冰上放置30分钟
10、12000 G离心10分钟(上清:细胞膜)
BufferA:10 mmol/L Hepes 7.5;10 mmol/L kcl;1.5 mmol/L Mgcl2;0.5 mmol/LDTT;1 mmol/LNaF;1 mmol/L glycerol phosphate;1 prptease inhibitor cocktail tablet/50ml
BufferB:BufferA+0.15% of Nonidet P-40;
BufferC:20 mmol/L Hepes 7.5;420 mmol/L Nacl;1.5 mmol/L Mgcl2;0.5 mmol/LDTT;1 mmol/LNaF;1 mmol/L glycerol phosphate;1 prptease inhibitor cocktail tablet/50ml