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细胞破碎的方法

发布时间: 2014-11-17  点击次数: 1197次

一、细胞器的分离:制备某种生物大分子时,往往需要采用细胞中某一部分为材料;或者为了纯化某一特定细胞器上的生物大分子,通常破碎细胞后,先分离各组分,以防干扰,这对制备—些高难度和高纯度的生物大分子是必要的,细胞器的分离,一般采用差速离心法,此法是利用细胞各组分质量大小不同,在离心管不同区域沉降的原理,分离出所需组分,分离得到的细胞器,其纯度可采用电子显微镜法、免疫学法或测定标志酶活力法进行鉴定。

二、细胞器的分离有时需要将组织细胞破碎,然后根据待分离的细胞器的理化特性,选择适当的分离方法。一般采用差速离心或密度梯度离心的方法达到分离细胞器的目的。

三、破碎方法:

(1)杆状玻璃匀浆器法:该匀浆器由一根端部表面磨砂的玻璃杆和一个内壁磨砂的玻璃套管组成。使用时,先用锋利的刀片把组织块切碎,然后把碎块加入套管中,用力使玻杆移动使组织细胞破碎。

(2)高速组织捣碎机法:使用时将4℃预冷的组织碎块或细胞悬液加入捣碎机的梅花玻璃杯中,至杯体积的1/3即可盖好玻璃杯盖,固定好带杆叶片刀,缓慢调整旋转速度,一般开机数十秒后,组织细胞即可被高速旋转的叶片刀破碎。但不宜时间过长,以防高速旋转产生热而导致分离物中的活性物降解,用冷却水降温更好。

(3)超声波处理法:超声波发生器能产生高强度的超声信号,经换能器传送至与之接触的溶液中,由声波形成冲击和振动而产生剪力,致使细胞破碎,动物组织肝、肾、胸腺、淋巴结、腹水细胞、红细胞、体外培养的细胞均可在短时间内破碎,因超声时可产热,应注意冰浴冷却,生物大分子如核酸和酶对超声敏感,一般不宜采用。

(4)化学裂介法:在细胞悬液中加入Triton-100、NP-40、SDS,去氧胆酸钠均可使细胞裂解,往往仍需机械去辅助,方可在短时间内使细胞*裂解,裂解后应清除化学裂解剂,以防止干扰分析。

(5)反复冻融法:组织细胞浓液在-70℃或液氢中冷冻后,于37℃融化,经3-4次冻融周期,可使细胞破碎。

另外,部分细胞器的分离一般采用差速离心或密度梯度离心的方法得到分离细胞器。

四、具体细胞器的分离方法选用:

(1)细胞膜的分离:细胞膜又称质膜,分离细胞膜有助于研究生物膜的结构与功能。一般说,红细胞膜与线粒体膜的制备用差速离心法即可,其他细胞膜的分离可根据膜组分的密度大小不同,采用梯度离心后,分布于区域,可分离得到纯制品。

(2)线粒体的分离:线粒体普遍存在于真核细胞中,它是细胞呼吸的主要场所,细胞活动所需能量主要依靠在线粒体内进行氧化所产生的能,线粒体的分离主要靠差速分离。

(3)线粒体膜分离:线粒体膜分离方法主要是密度梯度离心。

(4)聚核糖体的分离:核糖体是由核糖酸和蛋白质组成的核糖核酸蛋白颗粒,附着在粗面内质网的称固着核糖体,分散在细胞内的称游离核糖体,数个或数十个核蛋白体聚在一起称为聚核糖体,一般用差速离心法可分离出聚核糖体。

(5)微粒体分离:微粒体是一种脂蛋白所包围的囊泡,含核糖核酸,蛋白质和脂类,分离微粒体的方法是利用分级离心法,去掉细胞核和线粒体后,经超速离心而制备。

(6)细胞核的分离:不同组织来源的细胞经匀浆后,可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。