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肝星状细胞培养

发布时间: 2014-11-05  点击次数: 522次

材料

相差显微镜,荧光显微镜,手术器械,雄性SD大鼠,体重250-450 g,戊巴比妥钠,200目尼龙网,小牛血清(或胎牛血清,则更好),DMEM,胰酶消化液(以HBSS配),Nycodenz(以GBSS配),D-Hanks'(KCl 0.4 g/L,KH2PO4 0.06 g/L,NaCl 8.0 g/L,NaHCO3 0.35 g/L,Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,可加酚红 0.02 g/L),HBSS,台盼兰等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->门静脉插管-->D-Hanks'液灌注,同时剪开下腔静脉-->灌以胰酶消化液-->离体肝脏并剪碎-->继续消化-->以尼龙网过滤-->450 g X 5'(4度,下同)-->ppt以HBSS重悬-->混以Nycodenz液-->转至离心管,并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面细胞-->重悬、离心收集细胞-->细胞计数,并判断存活率和产量-->按照常规接种-->次日换液。

传代方法:弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化-->镜下观察细胞突起回缩(2-5分钟左右)-->以*培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA,可以不需离心)-->吹打,1:2-1:3接种,然后继续培养(5% CO2,37度)。

结果

次日,光镜下可见细胞呈星芒状,胞质内有脂滴,荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上本人发表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(见插图)。

讨论

进一步鉴别需要做免疫组化:Desmin和alpha-SMA;后者在细胞激活后才表达。

也采用过无须原位消化的方案,*可行,只不过消化时间更难控制!

参考文献

袁桃霞,张锦生,张月娥,等. 大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93.