公司关于鲎试剂在细菌内毒素检查法中使用的探讨

1 鲎试剂的分类

　　鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，于细菌内毒素检测。

　　1.1 按原料来源分 一种是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate），缩写为LAL，由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂（Tachypleus Amebocyte Lysate），缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。

　　1.2 按实验方法分 细菌内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为：凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。

　　凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

　　动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。

　　1.3 按使用特点分

　　1.3.1 普通鲎试剂 灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素*的样品。

　　1.3.2 高灵敏度鲎试剂 灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素*较低的样品细菌内毒素检查。

　　1.3.3 特异性鲎试剂 灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰的样品[2]。

　　1.3.4 定量法鲎试剂 zui低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

　　2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用

　　内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[3]，而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以，一定要严格执行鲎试剂的质量标准，规范使用鲎试剂。

　　2.1 保证所使用鲎试剂的质量 鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面：灵敏度稳定;自凝时间不低于24h[4];具有一定的缓冲能力与合适的pH;反应后即形成坚实凝胶，将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后（如半年）其灵敏度可能发生变化，而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化[5]。因此，需选择具有国家颁发的批准文号,质量稳定的鲎试剂。

　　2.2 对鲎试剂灵敏度进行监测性复核 由于不同厂家鲎试剂质量不尽相同，即便是相同厂家不同批号的鲎试剂也有差异,这便导致鲎试剂灵敏度复核值与标示值不尽一致，因此鲎试剂的复核值对检测结果有显著影响[6]。每使用新批号鲎试剂时应复核其灵敏度;对留样鲎试剂自生产之日起，每6个月进行一次灵敏度检测，其灵敏度在有效期内应符合规定。有研究表明，鲎试剂的灵敏度在符合标准规定及适当的贮存条件下,3年内其灵敏度变化不大，是稳定的。建议可适当延长其有效期[7,8]。因此，对鲎试剂灵敏度进行监测性复核有利于确保实验的准确性，同时可以zui大程度地使用鲎试剂。

　　2.3 使用过程正确操作 选择合适的操作方法与顺序，在鲎试剂的使用过程中尤为重要。在操作过程中要注意以下几点：（1）实验室要求洁净、无尘埃流通;检验人员同时注意卫生的保持。在整个使用操作过程中应防止微生物的污染，例如空气的流动，人员的口沫、汗液污染等。（2）鲎试剂开启、溶解和配制时应尽量避免将安瓿外瓶壁脏物、瓶壁碎片、砂轮锯屑等异物混入鲎试剂中，避免鲎试剂外损。（3）鲎试剂中含有多种蛋白质，用力振摇会产生气泡，一旦起泡难以消除，而影响检测的准确性，所以在整个操作过程中都要轻力以避免因过分震动而引起的误差。（4）量取和加样反应物时，一定要加到试管底部接近鲎试液而不接触鲎试液的管壁处。（5）生成凝胶的zui适pH值为6～8，对于氯化钠注射液、葡萄糖注射液（5%,10%）等注射液，不需考虑供试液的pH值，而检查其他制剂时，尤其是一些本身缓冲能力较强或偏酸、碱的供试品，应考虑供试品的pH值[5]。（6）使用时要严格控制温度和时间。当鲎试剂一加入内毒素及样品混合液中时反应已开始，并在一定的温度范围内，反应温度越高，反应速率越大;保温时间的增长，也会提高鲎试剂的灵敏度，增加假阳性的发生[9]，导致较大误差。因此，要注意控制温度的变化和保温时间。（7）保持实验器具的洁净。每次检验完毕，应及时将玻璃器具充分清洗后于250℃干热灭菌处理，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1h[10]。也可用其他经确证不干扰细菌内毒素的检查的适宜方法。对于塑料、橡胶等不耐热器材可用30%双氧水浸泡4h，用无热原水冲洗，70℃干燥备用。

　　2.4 鲎试剂的贮存 虽然冻干的鲎试剂在常温条件下是相对稳定的，但还是应存放在2℃～8℃下，避免长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当、质量下降而引起的检验误差。

　　3 建议

　　3.1 一般中草药注射液由于成分复杂，以及含糖注射液中常含有β-葡聚糖[11]，使其干扰因素较多。而使用特异性鲎试剂，可利用其能够屏蔽β-葡聚糖引起的鲎试剂凝聚反应，仅与内毒素反应的原理，以消除干扰[12～14]，从而减少或消除假阳性反应[15]。

　　3.2 当夏天室温较高时，控制鲎试剂使用过程中温度的变化，可通过在冰水浴中进行加样以取得较好效果;同时，实验操作从鲎试剂的复溶到放入恒温仪应尽量在1.5h内完成。

　　3.3 虽然目前的鲎试剂相对稳定很多，但还是应存放于2℃～8℃的条件下，并保持温度的稳定，如冰箱发生故障，无法保持温度时，就应及时更换贮存设备。

　　3.4 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中放置在冰冷的表面上或于2℃～8℃的冰箱内存放24h以内;亦或在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下，可存放28天，但只能冻融一次。

【参考文献】
  　1 国家药典委员会.中国药典.北京:化学工业出版社,2005,二部，附录 85-88.

　　2 施震，尹银嘉，李华. 特异性鲎试剂和非特异性鲎试剂对艾迪注射液中细菌内毒素检测的比较. 中国生化药物杂志，2003，24（3）：137-138.

　　3 梁苹，蔡红. 鲎试剂灵敏度对细菌内毒素*的影响. 华西药学杂志，1999，14（3）：204-204.

　　4 卫生部. 部标准《鲎试剂》 修订稿. WS1-364（B-123）-91.

　　5 张红霞, 陈慧, 马金刚. 影响鲎试剂灵敏度测定结果因素的分析. 中国药师，2007，10（8）：825-826.

　　6 程义琳，吴蕙玲. 鲎试剂灵敏度对检测结果的影响. 中国药师，2005，8（4）：344-345.

　　7 陈引秀. 鲎试剂灵敏度稳定性的考察. 海峡药学，2004，16（3）：83-84.

　　8 金华. 鲎试剂灵敏度稳定性观察. 医学理论与实践，2004，17（1）：84-84.

　　9 黄冬，房判石.鲎试剂法检测细菌内毒素假阳性原因浅析. 首都医药，2002，9（5）：53-54.

　　10 中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范. 北京：中国医药科技.

　　11 叶良君，张强，张涛，等.β-葡聚糖对含糖大输液细菌内毒素检查的影响.中国药业，2008，17（19）：24-25.

　　12 黄东燕. 特异性鲎试剂检测当归注射液细菌内毒素. 中成药，2000，22（8）：541-543.

　　13 张贵宝，徐紫娟，白文东. 鲎试剂用于20%甘露醇注射液细菌内毒素检测. 工企医刊，2007，20（6）：18-20.

　　14 尹银嘉，商小曼. 特异性鲎试剂检测人参多糖注射液中的细菌内毒素. 中国医院药学杂志，2002，22（11）：677-679.

　　15 唐坤.弃G因子鲎试剂检测在大输液中应用. 华夏医学，2000，13（2）：219-221.