详细步骤:
1、挑10mm2的酵母溶于含50μl的TE ( pH7.0) 的1.5ml离心管中.
2、每管加10μl的裂解液(Lyticase 5 unit/μl, sigma避光保存),涡流混匀.
3、37℃,200-250r/m,30-60min.
4、每管加10 μl 20%SDS,涡流1min.
5、–20℃冻存过夜.
6、室温下融解后,涡流混匀.
7、质粒提取.
7.1 1.5ml离心管加TE Buf至200μl的(pH7.0)
7.2 200μl酚,涡流5min后,4℃,14000r/m离心10min.
7.3 取上清至干净的1.5ml Eppendorf管中.
7.4 等体积酚氯仿,涡流5min.
7.5 4℃,14000r/m离心10min.
7.6 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管后加等体积氯仿,涡流混匀.
7.7 4℃,14000r/m离心10min.
7.8 取上清至一干净的1.5ml Eppendorf管中.
7.9 8μl 10M NH4Ac和500μl 95%~100%的乙醇.
7.10 –70℃,1h.
7.11 4℃,14000r/m离心10min.
7.12 弃上清,空气中干燥.
7.13 10μl H2O悬浮细胞.
8、转化(要求:4℃预冷)
8.1 冰上融化感受态细胞(感受态细胞的制备见分子克隆啦)*0f’.
8.2 加100μl转化细胞到预冷的1.5ml离心管中,枪头轻轻吹打混匀.
8.3 冰上孵育30min.
8.4 42℃,45S~50S.
8.5 冰上孵育2min后,加1ml LB.
8.6 37℃,1h,250r/m.
8.7 2500r/m,5min,RT.
8.8 弃上清,在剩余的溶液中悬细胞.
8.9 接种LB/Amp板,37℃,倒置培养24h.
8.10 挑克隆,过夜培养,常规碱裂解法提质粒