质粒DNA的小量制备

准备工作： 
细菌培养：挑取单菌落，接种到3~5ml适宜的液体培养基(如氨苄青霉素抗性的标准lb培养基)中，37℃震荡培养。 
注：（1）在细菌的对数生长晚期时提取。过早则质粒得率太低，过晚则会有杂菌污染，或得到的质粒杂质太多，影响其后的酶切、电泳等处理； 
（2）某些严紧型质粒(如pBR322)需要在进入对数生长中期后，在细菌培养物中加入氯霉素继续培养，以提高产量。 

具体步骤： 
1、细菌的收获：将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30秒，吸去培养液。上清要务必吸取干净，否则会影响质粒的质量。必要时可以离心2次。 
2、将细菌沉淀重悬于150μl用冰预冷的溶液Ｉ中，加入1/50体积RNAseA贮存液，剧烈振荡，使之*分散。 
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0) 
不含dna酶的RNaseA：10mg/ml，TE配制，煮沸15~30min，-20℃分装贮存 
注：（1）溶液Ｉ高压蒸气灭菌后，贮存于4℃；（2）葡萄糖可以由NaCl代替，以利于储存；但提取大于15kb的质粒，应将细菌悬于等渗蔗糖溶液中，并用溶菌酶处理；（3）务必使细菌沉淀*分散，以利于碱液作用充分；（4）震荡时可以在离心管中加入牙签或枪头，提率；（5）配制RNaseA贮存液时，煮沸时间不宜过长或过短；（6）溶液Ｉ每2个月重新配制1次。 
3、加200μl溶液Ⅱ，颠倒混匀。 
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS 
注：（1）若菌体裂解得充分，则溶液会变得很粘稠；（2）不要剧烈震荡，否则会混入基因组DNA；（3）每2个月重新配制1次。 
4、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，轻微震荡混匀 
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 
注：（1）所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L，pH4.8左右；（2）尽量不要有大的块状沉淀，以利于下步离心；（3）每1个月重新配制1次，并分装贮存于小口瓶中。 
5、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 
6、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈震荡混匀。 
7、12000g离心5分种，将上层液体转移到另一离心管中。 
注：为了保证不吸出下层液体，可以先离心30秒，然后将上层与少量下层液体吸至另一离心管，离心5分种，再转移上层液体。切勿混入下层液体。 
8、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心５~10分钟，小心吸去上清液。 
注：（1）沉淀即为质粒DNA；（2）为确保质粒*沉淀，异丙醇的体积可以适当加大至62~65%。 
9、0.8ml70%乙醇洗涤DNA沉淀后，小心地吸去上清。在空气中静置3~10分钟，待沉淀干燥后，溶解于50μl高压灭菌的水中。 
注：为洗涤充分，可以洗2次。 
10、取1~2μl样品测定紫外吸光度，对所得质粒进行定量并了解其纯度，或取1~2μl样品进行琼脂糖电泳，估计其纯度和得率。 

所得质粒不能进行很好的酶促反应的主要原因：1、细菌收获时，培养液没有吸除干净；2、各种液体放置时间过长；3、沉淀中混入痕量酚、蛋白或过多乙醇；4、干燥沉淀时，在空气中静置时间过长（数小时） 
质粒得率过小的主要原因：1、细菌培养时间不够；2、细菌沉淀重悬于溶液Ｉ时，没有*分散；3、加溶液Ⅱ后，裂解得不充分；3、各种液体放置时间过长而失效；4、加入异丙醇的量不够；5、洗涤用的乙醇溶液浓度<60%；6、严紧型质粒应适当加大培养体积，并用氯霉素处理