PCR常见问题分析及对策

问题1：无扩增产物 
现象：正对照有条带，而样品则无 
原因: 
1.模板:含有抑制物，含量低 
2.Buffer对样品不合适 
3.引物设计不当或者发生降解 
4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 
对策: 
1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 
2.更换Buffer或调整浓度 
3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 
4.降低退火温度、延长延伸时间

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳

问题2：非特异性扩增 

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 
原因： 
1.引物特异性差 
2.模板或引物浓度过高 
3.酶量过多 
4.Mg2+浓度偏高 
5.退火温度偏低 
6.循环次数过多 
对策： 
1.重新设计引物或者使用巢式PCR 
2.适当降低模板或引物浓度 
3.适当减少酶量 
4.降低镁离子浓度 
5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 
6.减少循环次数 

问题3：拖尾 
PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 
原因： 
1.模板不纯 
2.Buffer不合适 
3.退火温度偏低 
4.酶量过多 
5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 
6.循环次数过多 
对策： 
1.纯化模板 
2.更换Buffer 
3.适当提高退火温度 
4.适量用酶 
5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 
6.减少循环次数 

问题4：假阳性 
现象：空白对照出现目的扩增产物 
原因： 
靶序列或扩增产物 
的交*污染 
对策： 
1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 
2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 
及加样枪头等均应一次性使用。 
3.各种试剂先进行分装，然后低温贮存