士锋细菌中蛋白质的提取与纯化技术

一、实验试剂

采用T7 Tag Affinity Purification Kit

T7 Tag抗体琼脂。B/W缓冲液：4.29 mM Na₂HPO₄，1.47 mM KH₂PO₄，2.7 mM KCl， 0.137 mM NaCl，1%吐温-20，pH7.3 洗脱缓冲液: 0.1 M柠檬酸，pH2.2 中和缓冲液：2 M Tris，pH10.4。 PEG 20 000。

二、实验步骤

1. 100 ml 含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5 000 g×5 min，弃上清，收获菌体，用10 ml预冷的B/W缓冲液重悬。

2.  重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心 14 000 g×30 min，取上清液，0.45 μm膜抽滤后作为样品液。

3.  将结合T7 Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。

4.  B/W缓冲液平衡后样品液过柱。

5.  10 ml B/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。

6.  用5 ml洗脱缓冲液过柱，每次1 ml，洗脱液用含150 μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7.  将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24 h，中间换液数次。

8.  用PEG 20000浓缩蛋白。

三、注意事项

蛋白在过层析柱前，要0.45 μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。