吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法

吖啶橙区分活细胞 DNA 和 RNA 的荧光组织化学染色法

    吖啶橙《acridine oran。AO)属于三环杂芳香类异嗜性阳离子荧光染料，主要以两种方式与核酸结合，一是嵌入核酸双链的碱基对之间；二是与单链核酸的磷酸发生静电相互作用。当吖啶橙与DNA或RNA结合时，zui大发射波长分别为525nm或650nm，产生绿色荧光或橙红色荧光，因此，吖啶橙是研究核酸的一种常用荧光组织化学 染料。下面介绍应用吖啶橙区分活细胞和原位组织细胞DNA和RNA荧光组织化学染色法。

    1．溶液配制

    (1)吖啶橙浓缩液(4℃、避光，可保存数月)

    双蒸水    50ml

    吖啶橙    50mg

    (2)甲液

    双蒸水        200ml

    HCl           16ml

    NaCl          1．74g

    Triton X-100    0．2ml

    (3)乙液

    0．2mol／LNa2HP04／0．1mol／L枸橼酸缓冲液(pH 6．0)

    双蒸水                100ml

    Na2 HP04?12H20      4．51g

    枸橼酸(无水柠檬酸)     0．71g

    溶解后，依次加入以下试剂和吖啶橙浓缩液

    NaCl(0．15mol／L)     0．87g

    EDTA-Na(1mmol／1)    0．037g

    吖啶橙浓缩液          0．6ml

    加入吖啶橙浓缩液后，应尽早使用。

    2．操作程序

    (1)取0．2ml含10％小牛血清的细胞悬液，再与0．4ml冷“甲液"混合，振荡15秒；

    (2)加入l.2ml"乙液"，充分混匀；

    (3)于10分钟内，荧光显微镜观察，激发波长为488nm。

    结果：DNA为黄绿色荧光，而RNA为橘红色荧光。如果同时进行DNA和RNA染色时，需用鳌合剂处理，使双链RNA变性，确保所有的RNA均为单链，而双链DNA不受影响，增加结果的可信性。鳌合剂以乙二胺四乙酸(EDTA)为佳。