制备率感受态注意事项

液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加zui终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存. 
TB溶液*TRANSFORMATION BUFFER 
PIPES 3.0G 10mM 
CaCl2.2H2O 2.2g 15mM 
KCl 18.6g 250mM 
add water up to 950ml 
用 5N KOH 调PH至6.7-6.8*低PH不溶 
在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g 
定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存. 
但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒. 
【zihudie】 
（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。 
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。 
（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 
（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 
（5）重复第4步操作。 
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。 
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。 
本法效率*,建议大家采纳 
【yog】 
1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5) 
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min 
3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min 
建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。 
以下为转贴，具体方法请查阅文献。 
E.coli感受态细胞制备方法: 
单菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600 
=0.2-0.4 
离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作. 
转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42oC 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml 
, 37oC 1小时后铺抗生素平板。 
TSS: 
7.0ml pH6.1 LB 
2.0ml 50% PEG6000 
0.5ML dmso 
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4) 
0.3ml ddH2O