琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶及血清LDH总活力的测定

能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶，称为同工酶。同工酶的蛋白结构既然有差别，它们的理化性质也就有所差异。因此可用电泳或其他方法将它们分离开来。例如乳酸脱氢酶（LDH）同工酶，它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸，但经电泳法分离后，就有5个同工酶区带。 
由于同工酶在不同组织、器官中的分布不同，即具有组织器官特异性。因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据，也被利用于生物分类及遗传育种等工作中。 
本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶五个同工酶（LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5）。血清乳酸脱氢酶的辅酶是NAD+。当它催化乳酸脱氢时，NAD+即被还原成NADH·H+。
琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶及血清LDH总活力的测定
如果还有氧化型吩嗪二甲酯硫酸盐（N-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate，简称PMS）和硝基蓝四唑（氮蓝四唑nitroblue tetrazolium，简称NBT）存在，则发生如下反应：

当LDH同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后，给予NAD+、底物（乳酸）、PMS和NBT，同工酶区带即呈蓝紫色。乳酸脱氢酶在辅酶I的递氢作用下，使乳酸脱氢而生成丙酮酸。 
LDH分子量约14万。草酸、乙二胺四乙酸对本酶有抑制作用，所以血浆不适宜测定乳酸脱氢酶活力。此外，硼酸、汞离子、对氯汞苯甲酸以及过量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用。 
乳酸脱氢酶催化反应是碳水化合物代谢中无氧糖酵解的zui终反应，广泛存在于人体各种组织中，按新鲜重量计算，乳酸脱氢酶活力依下列顺序降低：肾脏＞心肌、骨胳肌＞胰＞脾＞肝＞肺。血清中含量很低，红细胞中含量较血清约高100倍，故测定时应避免溶血。如不能及时测定，血清应及早和血块分离，避免红细胞中乳酸脱氢酶逸入血清中。 
乳酸脱氢酶测定的方法很多，根据酶作用的反应可分为二大类：一类利用顺向反应以乳酸为基质；另一类利用逆向反应，以丙酮酸为基质。根据测定方法不同又可分为紫外分光光度法和可见分光光度法。紫外分光光度法需用紫外分光光度计测定反应中辅酶I量的变化。可见分光光度法利用2，4—二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕色。目前较多使用以乳酸为基质的方法，此法所需的氧化型辅酶I较稳定，不似以丙酮酸为基质的方法需用的还原型辅酶I很不稳定（在-20℃也不能长期保存）。氧化型辅酶I价格也较低。此外，乳酸钠基质液也比丙酮酸基质稳定，室温中可放1个月。 
近来有人利用顺向反应形成的还原型辅酶I可以还原某些染料如2，6—二氯酚-吲哚酚（2，6-dichlorophenol-indophenol）、氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑（INT）建立了另外一种类型呈色反应，并以吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）或黄递酶（diapho-rase）作为还原型辅酶I和染料之间的递氢体。此法快速，操作简单，重复性较好。乳酸脱氢酶同工酶显色一般也多利用此类还原四唑蓝方法。
三、器材及试剂：
1.器材：