如何从RNA抽提到电泳鉴定

RNA抽提

一，准备工作

1， 实验器具与材料：

（1） 移液枪：1ml、200ul、10ul

（2） 吸头：1ml、200ul、20ul

（3） 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个

（4） EP管1.5ml、100ul

（5） 玻璃研磨器

（6） 容量瓶：1000ml

（7） 盐水瓶：100ml

（8） 15ml塑料管一个（配75％乙醇用）

2， 实验器具的处理与准备

（1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等）

将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。

（2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器）

先泡酸，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。

（3） 金属制品：（镊子等）

先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）

3， 试剂配制和准备：

（1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃，送至高压。

（2） 75％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。

（3） 异丙醇：放入棕色瓶

（4） 氯仿：放入棕色瓶

（5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃

二，抽提时注意事项：

全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

三，抽提步骤

1．匀浆化作用

取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。

2．分离阶段

每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。

3．RNA的沉淀

将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。

4．RNA的洗脱

小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。

5．RNA的再溶解

小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀*干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。

6，RNA的保存

提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。

TRIzol法抽提总RNA细胞

组织100mg  1×107

↓

加1mlTRIzol

↓细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块

匀浆（要*，后转至EP管）

（组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管）

↓

颠倒混匀10下，室温5分钟

↓

加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）

↓

颠倒混匀15S，室温5分钟

↓

4℃，离心12000rmp，15分钟

↓

转上层水相（约400-500μl）于另一新1.5mlEP管中

↓

加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀后-20℃中1小时

↓

4℃，离心12000rmp，10分钟

↓

弃上清

↓

加冰预冷的75%乙醇（用高压后的DEPC水配）1ml

↓

4℃离心7500rmp，5分钟

↓

弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能*干燥）

↓

溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl）

（可在55-60℃水中，<10分钟助溶）

↓

立即保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录