RAPD技术及其在假丝酵母菌研究中的应用

近年来，随着肿瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等患者的不断增多，侵入性诊断治疗手段的广泛实施，各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，临床上真菌感染呈明显上升趋势［1］，其中假丝酵母菌在医院真菌感染中zui常见，占80%以上［2］，故快速、准确地对其鉴定、分型并分析该菌种间、种内的亲缘关系对研究假丝酵母菌的致病性、药物敏感性、预防监测流行病学调查具有重要意义。传统的真菌分型方法主要是表型分型如形态学法、血清学法、药物敏感性分型等，但耗时费力，易受环境及人为因素的影响，鉴别力弱，稳定性差。随着分子生物学的发展，DNA分析技术广泛应用于病原微生物的检测，如：限制性片段长度多态性分析（RFLP），单链构象多态性分析（SSCP），随机扩增DNA多态性（RAPD），脉冲场凝胶电泳等，其中RAPD技术具有简便快速，短期内可以分析大量样本等特点，在医学真菌研究中显示出巨大的潜力。

1 RAPD的基本原理

随机扩增多态性DNA分型法（random amplied polymorphic DNA,RAPD）又称任意酶链反应(Arbitrily primer PCR,AP-PCR)，由Williams等［3］于1990年创用，该方法利用任意10个左右的寡聚核苷酸链作引物，以所研究的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物（即DNA片段）通过琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙腚（EB）染色检测多态性，在扩增条件相同的情况下，不同种属的个体基因组成相差明显，扩增产物呈现不同电泳带型，同种内不同个体由于基因突变、插入、缺失或置换影响引物的特定结合位点，导致DNA扩增条带增多、减少或长度改变，而同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的被认为具有同源性，因此不仅反映生物个体之间的遗传稳定性，也能同时清晰敏感地反映出遗传差异。

2 RAPD技术的主要优势

RAPD方法建立在PCR基础之上，因此具有模板用量少、技术简单、灵敏度高和特异性强等优点，但与其他DNA多态分析方法相比较，还有其*的优势。

*，RAPD勿需知道模板DNA任何序列信息，对其进行扩增，构建不同种、不同菌株的基因指纹图谱，进而分析DNA的多态性，这是其他方法进行此类研究所不能比拟的［4］。

第二，鉴别力强。Bostock［5］等将RAPD与PFGE、REA-RFLPs进行比较分析发现15株白假丝酵母菌中，PFGE产生14个电泳核型，E.CORI-RFLPs产生7种不同的DNA型别,而RAPD则能分出13个亚型，是一种快速简捷的方法并有着与PFGE类似的分辨力。随后许多学者进行了类似的研究［6-8］，对RAPD予以高度评价，认为目前已有的分型方法中，RAPD可能是*位选择。

第三，RAPD技术无需DNA探针，不涉及Southern杂交，放射自显影或其他技术，操作步骤少，实验周期短，成本较低，能在较短的时间内筛选大量样品。

3 RAPD技术在假丝酵母菌研究中的应用

3.1 用于种间及种内菌株分型 假丝酵母菌是条件致病菌感染中zui常见菌群，其种间及种内分型具有重要的流行病学及临床意义。Robert［9］等应用1个10bp随机引物RAPD方法将分离自非相关患者不同解剖部位的32株白假丝酵母菌分成22个不同的DNA型别。项明洁等［10］采用优化实验条件对自上海瑞金医院临床分离的22株酵母菌菌株进行RAPD分析，从而得到假丝酵母菌具有不同的扩增指纹，进而揭示了RAPD在酵母菌分型中的应用。廉翠红等［11］利用两条随机引物RAPD方法，将来源于不同阴道念珠菌病患者的97株临床分离株分别分成19个和21个型别。可见，RAPD具有很好的分型能力。