引物（primers）设计

引物（primers)

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，

一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，

另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。

引物的重要性
在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求dna聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。

引物设计原则
引物长度 
一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但zui多不超过50个核苷酸。

碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%
GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性
GC含量太高也易于引发非特异扩增。

引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。
计算：
对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“zui近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件zui常用的计算方式。
Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15

引物二级结构
引物二聚体
尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补
发夹结构
尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。

引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增*失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端zui后一个碱基不与密码子第三个碱基配对。