碱性磷酸酶偶氮―偶联 法

人工合成的磷酸萘酚盐经碱性磷酸酶 水解后释放出萘酚，后者立即与重氮盐偶联生成不溶性偶氮色素。

    1)孵育液配制

    萘酚AS(或萘酚AS-MX)                              10―25rug

    N，N―二甲基甲酰胺液                             0．5ml

    0．2mol／LTris盐酸缓冲液(pH 8．2―9．2)          50ml

    坚牢蓝B(或BB、RR，或坚牢红TR、坚牢蓝VRT)         50mg

    混合、搅拌及过滤，必要时可使用氢氧化钠调整pH。

    2)操作程序：

    ①新鲜组织冰冻切片：

    ②人孵育液，37C(或室温下)孵育5―60分钟；

    ③双蒸水洗3～5分钟；

    ④4％甲醛，室温下固定10～15分钟；

    ⑤蒸馏水洗3～5分钟；

    ⑥甘油明胶封固。

    3)结果与评价：采用不同的重氮盐。酶的活性显色也不同，用坚牢蓝B(或BB、RR)酶活性呈蓝紫色，用坚牢红TR(或坚牢紫B)酶活性呈红色。萘酚法有三个优点：

    ①反应产物溶解度小。局部比较明显；

    ②萘酚化合物能较快地被水解，可缩短孵育时间；

    ③反应产物立即可见，并显示出颜色。

    4)对照实验：方法与钙―钴法相同。