PCR产物的克隆技术

在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的dna片段。此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。

1. 平末端连接：由于Taq dna聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。

2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。

3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。

第二节 材料、设备及试剂

一、材料

不同来源的模板DNA。

二、设备

移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，DNA扩增仪(PE公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机。

三、试剂：

1、10×pcr反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0% Triton X-100。

2、MgCl2 ：25mmol/L。

3、4种dNTP混合物:每种2.5mmol/L。

4、Taq DNA聚合酶5U/μl。

5、T4 DNA连接酶及连接缓冲液：配方见第五章。

6、经SmaⅠ酶切和加dT的pUC质粒。

7、其它试剂：矿物油(石蜡油)，1% 琼脂糖，5×TBE，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇和70% 乙醇。

第三节 操作步骤

一、PCR反应

1. 依次混匀下列试剂

35μl H2 O

5μl 10×PCR反应缓冲液

4μl 25mmol/L MgCl2

4μl 4种dNTP

0.5μl 上游引物(引物1)

0.5μl 下游引物(引物2)

0.5μl 模板DNA(约1ng)

混匀后离心5秒。

2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。

3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。zui后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。

二、电泳

按第二章所述,取10μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。

三、PCR产物的纯化

扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。

(一)酚/氯仿法

1.取反应产物加100μl TE.。

2.加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中. 这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。

3.再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。

4.在水相中加300μl 95%乙醇,置-20℃下30min沉淀。

5.在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。

(二)Wizard PCR DNA纯化系统

Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA，提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。

该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化，试剂包括：

50ml Wizard PCR DNA纯化树脂

5ml 直接提取缓冲液

50支 Wizard微型柱

1、吸取PCR反应液水相放于1.5ml eppendorf管中。

2、加100ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。

3、加1ml PCR DNA纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。

4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。

5、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml 80%异丙 醇，对微型柱进行清洗。

6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。

7、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE或水，静止1分钟后，12000g离心20秒。

8、丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化DNA，存放于4℃或-20℃。

[注意] 1、纯化树脂在使用前必须充分混匀。

2、PCR产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取DNA的 产量。

四、载体加dT尾

1.将1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。

2.在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4μl 4种dNTP改为4μl 25mM dTTP。

3.加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2h。

4.按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。

5.加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1hr。

6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR产物与载体粘末端连接

1、在7ml PCR产物中加1ml带dT尾的pUC质粒。

2、加1ml T4DNA连接酶，1ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接。

3、取5ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接

1. 在50ml的PCR产物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混匀。

2. 37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。

3. 用酚:氯仿抽提2次。

4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。

5. 质粒用Smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1ml (约0.1mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1ml ，连接缓冲液1ml 。

6. 取5ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。

[注意]1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。

2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。

3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。

4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。