士锋生物电泳、转膜

转膜是把DNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定，是进行各种后续研究（如RFLP分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究）的前提。 

实验目的：掌握Southern Blotting的原理及操作步骤 
实验原理： 
1. 转膜的方式： 
向上的毛细管转移 
向下的毛细管转移 
同时向两张膜转移 
电转移 
真空转移 
2. 固相支持物的种类及选择： 
硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA，< 500 bp的DNA无效，转膜前的工作（从提高转膜效率，利于转膜后使用等） 
尼龙膜（带正电荷的）高强度，不易破损，具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以上（10-20次），经毛细管（毛细吸附）作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，在80-100℃真空干燥2-4 hrs，即可固定DNA。 
3. 转移缓冲液（transfer buffer）的选择： 
带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（SSC），但不能充分发挥膜潜能；0.4N NaOH，共价结合DNA是zui大优点。 
硝酸纤维膜：高盐离子强度促进DNA与膜结合（20×SSC），低盐离子强度导致小片段DNA在转移过程中丢失，pH>9，DNA不能与膜结合。 
4．转膜时间（duration of transfer）约12 hrs 
效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。 
实验材料及试剂：酶消化好的DNA样品，尼龙膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等 
实验步骤： 
1． 0.8%琼脂糖电泳 
制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽配制250ml 0.8%琼脂糖凝胶，采用42孔梳子（经济，） 
制样，点样：DNA样品中指示剂量稍多 
电泳：一般1-1.5V/cm的电压， 使DNA迁移到适当距离，一般指示剂约移动10-11cm (大电泳槽：40V×12-15hrs，小电泳槽30V×4-5 hrs) 
2．转膜前的准备： 
依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸（11×12.5 cm），两张用作盐桥的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜（10×10.5cm），两个玻璃盘、两块有机玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。 
3．一玻璃盘中加入足量的0.4N NaOH，放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥(操作示范)。 
4．凝胶的预处理: 
a) 从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（zui后一个样品的zui前端）作为电泳方向记号 
b) 把凝胶翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盘中，轻轻摇动10min，使指示剂变黄色为止（脱嘌呤） 
c) 倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶 
d) 倒去蒸馏水，加0.4N NaOH中和 
e) 同时在盐桥滤纸上洒些0.4 NaOH，立即将胶放在盐桥上（忌气泡） 
5．胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接） 
6．在胶面上倒足够量0.4N NaOH，小心放置膜（预湿0.4N NaOH）使膜覆盖整块胶（要求一次成功，不能移动） 
7．膜上放2张滤纸，滤纸大小为15×12cm 
8．放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约500g的重物，转膜12 hrs左右 
9．转膜完毕，用2×SSC漂洗膜两次，各五分钟。用EB染胶以检测转移效果。 
10．用两张滤纸包住膜，置于80-100℃的真空干燥箱中，干燥2-4 hrs。