士锋生物牛副结核ELISA实验材料和步骤

 （一）材料与试剂 

1．副结核分枝杆菌亲和层析抗原 

2．草分枝杆菌吸收抗原 

3．兔抗牛IgG酶标抗体 

4．牛副结核病参考阳性血清 

5．牛副结核病参考阴性血清 

1～5项均由单位供应。 

6．器材 elisa板, 酶联免疫吸附检测仪、加样器、洗瓶、恒温箱等。 

7．试剂及溶液配制同第五节猪瘟ELISA。 

（二）操作方法 

1．抗原包被 以抗原稀释液将副结核亲和层析抗原稀释至50µg/ml,每孔包被0.1ml。部分对照孔以牛血清白蛋白（50µg/ml）包被。 

2．血清处理 取待检血清、参考阳性血清、参考阴性血清各0.10ml，加生理盐水0.80ml，加草分枝杆菌吸收抗原0.10ml，混匀，37℃感作1h。取0.10ml，加血清稀释液0.90ml（注意血清稀释液中加牛血清白蛋白，不加犊牛血清）。混匀即可 

3．正式试验 按表12－4进行。每个样品加2孔，以求OD平均值。 

表12－4 ELISA试验程序表（单位ml）

（三）结果判定

在对照组成立的前提下, 即参考阳性血清呈棕黄色,参考阴性血清及其它对照孔呈无色或浅黄色, 判定待测结果。

1．目测判定 与参考阳性血清孔颜色相当，即呈棕黄色，判为ELISA阳性（＋）。

2．酶标仪判定（490nm） 以底物溶液对照孔调零，校正参考阳性血清OD值为1.0（或相应规定值），测定待检孔。当OD≥0.50，判ELISA阳性（＋）；0.40≤OD≤0.49判ELISA可凝（±）；OD<0.40，判ELISA阴性（－）。