如何用BCA（二辛可酸）进行法蛋白定量

 

实验原理：

 

BCA（bicinchoninic acid）法蛋白浓度定量：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+（biuret reaction）。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

 

实验步骤：

 

1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solutionB试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。

 

2.稀释标准品：*溶解蛋白质标准品（5mg/mlBSA,-20℃保存）取10微升用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。

 

将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。

 

3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液不足道20ul。

 

即：将蛋白质样品作适当稀释（多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释。

 

4.在 各孔中加入200微升BCA工作液，这时使用加样枪轻柔吹打，将其中液体混匀，这时请注意，尽量小一点力气轻柔一点，不要弄出很多气泡，这样会影响读数），然后再37℃室内放置30-60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定A562nm，或540-590nm之间的波长的吸光值，zui后可根据标准曲线计算出蛋白质的浓度，为样品蛋白质定量。