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士锋科技淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体制备方法

发布时间: 2013-07-18  点击次数: 1746次

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序,逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一) 免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1. 颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

          初次免疫       1×107/0.5ml ip (腹腔内注射)
            ↓ 2~3周后
          第二次免疫      1×107/0.5ml ip
            ↓ 3周后
          加强免疫(融合前三天) 1×107/0.5ml ip或iv(静脉内注射)
            ↓
          取脾融合
 

2. 可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂:福氏*佐剂,福氏不*佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏*佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

      初次免疫  Ag 1~50μg 加福氏*佐剂皮下多点注射
        │     (一般0.8~1ml 0.2ml/点)
        ↓3周后
      第二次免疫 剂量同上,加福氏不*佐剂皮下或ip
        │       (ip剂量不宜超过0.5ml)
        ↓3周后
       第三次免疫 剂量同上,不加佐剂,ip
        │ (5~7天后采血测其效价,检测免疫效果)
        ↓2~3周后
      加强免疫,剂量50~500μg为宜,ip或iv
        ↓3天后
       取脾融合
 

取脾融合

目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性。

(二) 饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中,许多环节需要加饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有:小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞,使用比较方便,照射后可放入液氮罐长期保存,随用随复苏。