有高特异性和高精度的胞嘧啶碱基编辑器

在一项新的研究中，高彩霞教授课题组基于截短的人APOBEC3胞嘧啶脱氨酶（A3Bctd）构建出两种新的CBE，并开发出一种高通量检测方法，用于评估植物CBE中不依赖于单向导RNA（sgRNA）的脱氨变化。
 

他们首先开发了一种快速、高通量且廉价的方法---nSaCas9介导的正交R环测定法---来评估植物中的CBE。在这种测定法中，正交CRISPR系统nSaCas9被用于在植物细胞中产生单链DNA（ssDNA）区域，作为不依赖于sgRNA的脱氨变化的靶标。为了评估nSaCas9介导的正交R环测定，他们将它与全基因组测序（WGS）测定进行了比较。

一致性的结果表明，nSaCas9介导的正交R-loop测定法为评估CBE的不依赖于sgRNA的脱靶活性提供了一种合理、快速和高通量的方法。

他们随后通过合理设计构建出16个A3Bctd脱氨酶变体，并评估了它们的在靶效率（on-target efficiency）和不依赖于sgRNA的脱靶活性。他们利用nSaCas9介导的正交R环测定法对这些A3Bctd-BE3变体进行了测试，并选择了7个与高效的在靶编辑活性和下降的脱靶活性相关的突变。之后，他们将这些突变进行组合，产生了9个新的具有双氨基酸或三氨基酸替换的A3Bctd-BE3变体。

通过这种方式，他们得到了两个新的CBE变体：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，这两个变体表现出高效的在靶活性和明显下降的不依赖于sgRNA的脱靶活性。

此外，这两种新的CBE变体在它们的靶位点上的编辑表现得更，主要产生单个和两个胞嘧啶（C）编辑。他们还通过全基因组测序验证了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特异性